薄层色谱法

什么是TLC？薄层色谱法（thinlayerchromatography,TLC）是将适宜的固定相喷涂（或喷雾）于玻璃板，塑料或铝基片上，成一均匀薄层。干燥后进行点样，展开，斑点定位；或与适宜的对照物随行对照比较，或用薄层扫描仪扫描，用于药物或其他化合物的分离，鉴别，检查或含量测定等。•TLC是一种简单、快速的色谱技术。TLC法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化的物质的分离。•薄层色谱不需要特殊设备，操作简单，试样和展开剂用量少，展开速度快。•TLC经常被用于探索柱色谱分离条件和监测柱色谱过程。•在进行化学反应时，可利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。概述一、发展历史1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色谱法”一书，促进了这一技术的发展。因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高，结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后发展了薄层色谱光密度扫描仪，各步操作实现了仪器化，并实现了计算机化。•二、特点:（薄层色谱与高效液相色谱的差别）1.固定相和流动相•TLC——流动相流动靠毛细作用力，流动相选择较少受限制，固定相不用再生。•HPLC是在封闭的系统内，流动相流量靠泵控制，溶剂选择受检测器限制，固定相需再生。2.样品处理•TLC要求没有HPLC严格。3.色谱分离•TLC可同时分离多个样品，并可采用相同或不同溶剂进行同向或双向多次展开，通常采用正相色谱，色谱后衍生化方便。•HPLC一次只能分离一个样品，通常采用反相色谱，色谱后衍生化受限制。4.对污染物抗受力•TLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均无影响。•HPLC——颗粒物质、腐蚀性物质、不可逆吸附物质均有大的影响。薄层色谱参数–一、保留参数–1.Rf值•用来表征斑点位置的基本参数是比移值，用Rf表示。•Rf=Ls/L0原点SRWLsL0Lr原点参比样品前沿–注意：–同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的。–在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值(Rf)n=1-(1-Rf)n•2.相对比移值（Rx）–在难以确定溶剂前沿的位置时，需要引入相对比移值（Rx）Rx=Ls/Lr–二、分离效能参数•1.理论塔板数•n=16[Ls/W]2，考虑静态扩散对起始斑点半峰宽的影响引入真实塔板数（n真实）•n真实=5.54[Ls/（b0.5-b0）]2•b0.5为样品斑点半峰宽，b0样品起始斑点半峰宽•塔板高度h真实=Ls/n真实–2.容量因子（k）–k=ts/tm（物质在两相中滞留时间之比）–又k=K（Vs/Vm）–Rf=Vm/（Vm+KVs）=1/（1+k）–k∞94210.50–Rf00.10.20.330.50.671–3.分离度–R=–因Ls=RfL0，同时对相邻的两个斑点，假定W1=W2=W–则R=L0=×⊿Rf–与n=16[Ls/W]2式合并，得：2(Ls.2-Ls.1)W1+W2Rf.2-Rf.1WL0W•Rf与R之间存在着如图所示关系：0.10.30.50.70.91RfR1.000.750.50.250Rf=0.3,R最高Rf在0.2-0.5,R变化不大Rf﹤0.1或﹥0.7,R下降流动相与固定相•液-固吸附——在该色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于三个因素：溶解能力流动相溶质吸附剂相互作用竞争固定相要求：纯度高，含杂质少；粒度，结构均匀一致，有一定的比表面积；在展开剂中不溶；与展开剂和式样组分不发生化学反应；具有适当的吸附能力；机械强度和稳定性。选择：分离亲脂性化合物，选择氧化铝，硅胶，乙酰化纤维素以及聚酰胺分离亲水性化合物，选择纤维素和离子交换纤维素及硅藻土。一般，被分离组的极性强，选择吸附能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强者。种类：•硅胶—为使用最广泛的薄层材料•氧化铝—有碱性、中性、酸性•硅藻土—为化学中性吸附剂•纤维素—天然多糖类•聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形成氢键的物质有特别的选择性•硅胶：化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。常用硅胶规格：–硅胶H，不含黏合剂–硅胶G，含煅石膏（硫酸钙）–硅胶S，用5%淀粉作黏合剂–硅胶，用羧甲基纤维素（CMC）作黏合剂–硅胶GF254，含煅石膏和一种无机荧光剂，即锰激活的硅酸锌，在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。•氧化铝碱性氧化铝(pH9.0)——分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维生素等；中性氧化铝(pH7.5)——分离酸性及对碱不稳定的化合物；酸性氧化铝(pH4.0)——酸性化合物的分离。活度也与含水量有关。流动相（展开剂）要求：待测组分很好地溶解不与组分发生化学反应；组分斑点圆而集中，无拖尾现象；注意Rf的选择。•选择：“相似相溶”原则同吸附柱色谱极性强的溶剂洗脱能力强常用溶剂的极性强弱顺序：水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳环己烷石油醚。•展开剂选择原则：根据被分离物质的极性Stahl简图：极性物质—活度低（活性级大）的吸附剂--极性展开剂•展开剂•先用单一溶剂展开，•若Rf值太小，•则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等，•如果Rf值太大，•则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)，以降低极性。可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。•流动相选择时需考虑溶剂的下列情况–一些溶剂如氯仿、乙醚一般含有微量乙醇作保护剂，有时需重蒸除去乙醇。–许多溶剂有吸湿性，使溶剂含水量不一致，导致实验难以重现。–溶剂储藏时间和条件对溶剂质量影响，应注意出厂日期。–混合流动相组分之间（或杂质）可能发生相互作用。–对于易挥发的溶剂，难于配制稳定组成的流动相。要求操作格外小心，同时混合流动相不应重复使用。•溶剂的选择性–指溶剂引起两种溶质位移差别的能力，即分离度。–R=1/4（-1）[k/（k+1）]–分离因子=k1/k2，k为k1和k2的平均值–由上式可见，R取决于三个因子：•理论塔片n主要是吸附剂性质的函数•k反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶剂强度决定•取决于吸附剂和流动相的组成n•溶剂优化规则：•增加溶剂强度，使Rf值增大，但也可能降低分离能力。•流动相中较强组分的体积比小于5%或大于50%，选择性最大，此时最有利于溶质与流动相组分的选择性相互作用。•用乙醚或甲醇代替流动相中的一种较强组分，由于形成氢键可改善选择性。•若出现斑点拖尾，可向流动相中加少量水，或降低薄层活性，有利于改善分离。•也可采用两种强溶剂与一种弱溶剂组成的三元混合流动相，此时，溶剂强度由弱溶剂控制，而溶剂选择性则由两强溶剂控制。•斑点的扩散与形状在TLC中斑点的移动与扩散是二维的，因为斑点在展开方向和与之垂直方向上的扩散速度是不相等的，展开剂的移动速度也是不等的，在单位体积或单位质量薄层内所含的溶剂量越接近溶剂前沿减少得越明显，直至溶剂前沿时为零，这一现象称为“溶剂的体积梯度”，在各种展开形式中均存在。当然，对于这一问题实际上只是在定量斑点浓度时才需要考虑。•同时一种成分的色谱行为会受到混合物中其他成分的影响，这种影响的大小取决于混合成分的种类、浓度、以及斑点间的距离等。这种影响一般使分配系数变小。如两个相邻斑点中后面的一个展开速度较其单独展开时为大。•固定相的活度及其调节在其他因素一定时，活度增加，Rf值减少，反之亦然。可通过预吸附溶剂分子，调节其表面活性。例如可将活化薄层板放在相对湿度恒定的空间里来达到调节活度的目的。•实际工作中常常使固定相预吸附一定量单一或混合溶剂蒸气，预吸附量越大，溶剂前沿运动速度越快，物质斑点的Rf值越小。•预吸附还可能影响Rf在0.6-1.0之间的斑点的分离。•在层析过程中发生的边缘效应就是由于这种因素引起的。尤其是使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf值比边缘的Rf值小，即边缘效应，若在展开前先将展开槽与薄层板用展开剂蒸气饱和后再展开，边缘效应可消失。采用双槽层析缸尤为有利。预吸附中展开中展开过程中用不同于展开剂的溶剂调节槽内气氛薄层色谱操作薄层板制备•载板——5cm×20cm、10cm×20cm、20×20cm的2mm厚的玻璃板•放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥，置干燥器中备用。•要求光滑、平整、洗净后不附水珠。•薄层板涂铺要求：均匀、平整、无气泡引起的凹坑和裂纹。例：–硅胶板（粒度10～40um）•硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即涂铺。•硅胶或硅胶G——以CMC为黏合剂。配制0.3%～0.8%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。•薄层板活化–涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。不同薄层活化条件略有不同，如：•硅胶110℃0.5-1h•氧化铝110℃30min•点样(关键点)–要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。–采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。–点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。–手工点样工具：定容玻璃毛细管（1–5ul），微量注射器。展开•展开方式：上行展开•展开过程：•展开缸预先用展开剂饱和，平衡系统，薄层板浸入展开剂展开（距边缘0.5-1cm），挥干展开剂•检测–物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭–化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、持久、专属、灵敏。定性、定量方法•定性方法–利用保留值•测定Rf值•测定相对Rf值，即Rx值。•利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）sb1b2b2sb1sb1b2点样第一次展开第二次展开–通过板上化学反应•反应后生成特征颜色的化合物•反应后生成复杂的混合物，根据生成物的“指纹”特征加以鉴定。•可用于定性的板上反应有：乙酰化、浓硫酸脱水、偶氮化、酯化、卤化、酸碱水解、硝化、氧化还原、热解和光化学反应等。通过加热、喷雾等方法施加反应试剂。–通过板上光谱图定性•直接测定薄层板上斑点的紫外或可见吸收光谱图，与平行点加的标准斑点的图谱对照。•可建立标准条件下的化合物的光谱图库，用计算机检索定性。–与其他技术连用•TLC-付里叶变换IR联用•TLC-MS联用•定量方法–间接定量——将薄层分离后物质斑点定量地洗脱下来，再对洗脱液定量。•分光光度法、HPLC法、GC法、质谱法–直接定量•斑点面积测量——用透明纸覆盖在薄层表面，描出斑点界限，然后测量其面积。•目测法——比较系列标准与样品的斑点面积大小、颜色深浅，得到样品的含量范围。–薄层仪扫描定量•定量计算–归一化法、内标法、外标法•方法认证–选择性——以分离度表示，当待测组分的Rf值在0.3–0.7之间，扫描峰拖尾因子在0.9–1.1之间时可以接受的分离度为R大于等于1.0–稳定性——考察在采样、样品预处理、贮存、展开，展开后处理等过程中的样品稳定性。–线性与范围——相应于待测组分检出量的20%-120%范围。–灵敏度——通常以标准曲线的斜率表示。–精密度•重复性——当待测组分的含量达0.5ug/斑点时,方法的重复性(RSD)应在3.0%以内。•中间精密度——多数情况下，RSD应在5.0%以内。•再现性——RSD一般应在10%以内。–检测限–定量限–准确度高效薄层色谱法（HPTLC）HPTLC是应用高效薄层板与薄层扫描仪相结合的方法，它是在普通TLC基础上发展起来的一种更为灵敏、高效、快速、精密、准确的色谱分析技术。高效薄层板•一般是使用粒度5~7μm的吸附剂，多用高聚物如聚丙烯酸等为粘合剂，薄层厚度一般为0.2㎜，它比普通包层板分离度好、灵敏度高、速度快。薄层性能•吸附颗粒小，流动相展开速率慢，容易