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染色质免疫沉淀(ChIP)染色质免疫沉淀技术是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。近年来，这种技术得到不断的发展和完善，帮助研究者判断在细胞核中基因组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰，也可结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，如本次实验分装PierceAgaroseChIPKit，此试剂盒，提供了简化的方法来实现交联反交联、蛋白消化、免疫沉淀和DNA纯化。相关试剂从冰箱里取出，室温解冻或冰上解冻待用。还需要16%甲醛，5MNaCl及RNase-freewater等本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司的ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及冰盒，芬兰百得公司提供的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅等。接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA交联，然后用微球菌核酸酶进行消化，进行免疫反应之后，解除蛋白质DNA的交联，最后回收得到的DNA。甲醛处理使蛋白质与DNA交联在实验前需将待用细胞，用胰酶消化，进行细胞计数后，调整细胞密度到所需的密度后，方可进行实验。在含相应细胞数量的细胞悬液中，根据细胞培养基的体积，加入16%的甲醛至终浓度为1%。轻柔颠倒混匀，通风橱中室温孵育10min。在含1%甲醛的培养基中加入10×GlycineSolution至终浓度为1×，混匀，室温孵育5min，目的是终止交联。3000×g离心5min，弃掉培养基，用适量预冷的PBS洗细胞，离心去除废液。重复用PBS洗细胞两次，小心悬浮。离心弃除废液，加入1ml含1%HaltCocktail的预冷PBS，悬浮细胞并将细胞悬浮液转移至1.5ml离心管中。3000×g离心5min可直接进行下一步骤。细胞裂解并用微球菌核酸酶进行消化MicrococcalNuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比常规的超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA与蛋白的复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。交联好的蛋白质与DNA的复合物，弃上清后，加入100μl预先准备好的已含蛋白酶抑制剂的预冷LysisBuffer1，上下吹打至混匀，漩涡振荡15s然后冰上放置10min，9000×g离心3min，弃上清，用100μl的微球菌核酸酶工作缓冲液重新悬浮沉淀。分别往离心管中加入0.25μl的微球菌核酸酶，上下吸打至混匀，37℃水浴箱中孵育15min，注意每隔5min取出颠倒混匀。温浴结束后加入10μlMicrococcalNucleaseStopSolution终止消化反应，短暂的漩涡振荡混匀，置于冰上静置5min，9000×g离心3min，弃上清，加入50μl已含蛋白酶抑制剂的LysisBuffer2，重悬沉淀，置于冰上静置15min，每5min进行漩涡震荡15s，9000×g离心5min，吸取上清至另一新的1.5ml离心管中，此时上清内含已消化好的染色质。这时可继续进行接下来的免疫沉淀反应实验，也可以将样品冻存于-80℃中备用。染色质免疫沉淀反应将上一步骤得到的上清，约50μl，转移5μl至另一新的离心管中作为Input对照。在剩下的45μl上清液中加入450μl的1×IPDilutionBuffer，混匀。在3个样品管中加入适量一抗，阳性对照是加入10μlAntiRNAPolymerasetwoAntibody，阴性对照是加入2μlNormalRabbitIgG，靶特异性反应一般一个反应加1-10μg抗体，视抗体滴度浓度而定。置于摇床上常温孵育2h或4℃孵育过夜，对于蛋白丰度较低的，建议孵育过夜效果较好。每个IP反应管中加入20μl琼脂糖树脂，混匀，置于摇床上，4℃条件下孵育1h。琼脂糖树脂孵育后，将整个反应体系转入2ml的含离心柱的收集管中。3000×g离心30s，弃尽收集管中的废液，将离心柱重新放入收集管中，依次用500μl的1-3IPWashBuffer洗离心柱，置于摇床上，4℃条件下孵育5min，3000×g离心30s，弃尽收集管中的废液，为了尽可能的去除离心柱的洗涤液，再次离心1min。蛋白酶K处理，解除交联往离心柱中加入150μl的1×IPElutionBuffer，进行树脂的洗涤。置于65℃条件下摇动孵育30min，假如很难洗涤，可延长孵育时间。同时，在孵育过程中，解冻Input对照样品。取出新的1.5ml离心管，加入5M的NaCl6μl和2μl20mg/ml蛋白酶K.若样品数较多，可配制总体系后再分装。同样，在已解冻好的Input对照中也加入相同含量的NaCl和蛋白酶K，混匀，静置待用。65℃孵育结束后，将离心柱从热板上取出，放在加有6μl5M的NaCl和2μl20mg/ml的蛋白酶K的1.5ml离心管中，6000×g离心1min。离心结束后，弃掉离心柱，盖好离心管后，漩涡震荡，置于热板中孵育1.5h。此时可将得到的DNA进行PCR检测。DNA纯化回收孵育结束后，往每个IP反应管和Input对照管加入750μlDNABindingBuffer，混匀。先吸取500μl混合液加到2mlDNA纯化柱内，室温放置1min，12000rpm离心1min，离心后，倒弃收集管内的液体，将剩余的样品加入到对应的离心柱内，离心，弃掉收集液。往离心柱内加入750μlDNAColumnWashBuffer，室温放置1min，10000rpm离心1min，倒弃收集管内的液体，再次离心2min，除去离心柱内残留液体。将DNA纯化柱置于新的1.5ml离心管上，加入50μl的DNAColumnElutionSolution至管内柱面上，放置1min，10000rpm离心1min。也可以将收集到的液体，重复洗离心柱，以提高DNA回收率。此时得到纯化好的DNA，用ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪进行DNA定量，即可用RTPCR或实时荧光定量PCR实验进行检测，具体方法可参见分子生物学教材的相关视频。实验结果与分析取分装得到的部分Input对照样品，于1.8%琼脂糖凝胶中检测片段大小，消化得到的片段大小，应该在150-350bp左右的片段，若片段过大，需要进行消化条件的优化，从图中可看出，本次微球菌核酸酶消化效果很好，片段大小基本都集中在150-350bp。纯化得到DNA，用试剂盒自带的针对GAPDH基因启动子的引物进行PCR扩增，反应结束后各取10μlPCR产物在1.8%琼脂糖凝胶上电泳。电泳显示Empty空白对照无扩增产物条带，阴性对照扩增产物少，条带基本看不到。InputDNA电泳条带最强，阳性对照得到预期中的目的条带，结果证实本实验的ChIP成功，可进行下一步的分析。同样，得到的结果也可用于realtimePCR分析，得到的结果与普通PCR扩增一致。疑问解答DoctorA，我们在做ChIP实验时，大家都说要做好对照实验的设计，那么对照该如何设计呢？ChIP的实验结果易受细胞数量多少、交联时间长短、消化片段大小、抗体的种类等多种因素影响，所以在做ChIP实验时，必须做好实验对照，否则难以对实验结果的可靠性进行判断。染色质断裂后，须按一定比例留取部分染色质溶液作为InputDNA用作内对照；目的抗体沉淀蛋白DNA复合物时，还应同时设立阳性抗体和阴性抗体对照，只有将目的抗体的结果与阳性及阴性抗体的结果互相比较，才能得到正确结论。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，通常是组蛋白抗体或RNAPolymerasetwo抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的血清。DoctorA，您在实验中，以及上个问题中提到的Input对照，它是怎么来的，重要性体现在哪里呢？在进行免疫沉淀前，取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。在第一个提问中，DoctorA您提到DNA最好被断裂成150-1000bp大小的片段，但是有时候却检测出来染色质过长或过短，如大于1000bp或小于100bp，原因是什么，如何解决呢？交联时间太长，细胞与MN酶比例太大都会造成染色质片段过长，这时需要缩短甲醛交联的时间，交联时间一般控制在5-60min，交联时间过长，细胞染色质难以破碎，造成片段过长，影响ChIP结果，并且实验材料也容易在离心中丢失。同时，还需要优化MicrococcalNucleas消化步骤，增加酶量或是减少细胞的数量。相反，若细胞与MicrococcalNuclease比例太低，就会造成片段过短。若想得到一个好的实验结果，抗体的选择需要注意什么呢？染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性。