低聚木糖

低聚木糖分离提纯的研究进展蒋随新陈桂光*（广西大学生物工程系，广西南宁530004）摘要：低聚木糖是一种非消化的寡糖，能选择的增殖肠道内的双歧杆菌，木二糖是低聚木糖的主要成分，是目前发现的最强的双歧因子。因此具有营养和医用的功能特性。低聚木糖的分离纯化主要有：层析分离（凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析）；膜分离（超滤、纳滤、反渗透）。单一组分的提纯主要有凝胶层析和吸附层析。关键词：低聚木糖，分离，提纯ProgressinIsolationandPurificationofXylooligosaccharidesSuixinJiangGuiguangChen*(BiologicalEngineering,GuangxiUniversity)Abstract：Xylodigosaccharidesconsideredasnorrdigestibleoligosaccharides(NDO)canspecificallypromotethegrowthofbifidobacteriawithintheintestinaltractandcanbeextensivelyusedinfoodindustryandfeedindustry.Zhemethodsofisolationandpurificationxylooligosaccharidesincludechromatography(e.g.gelfiltrationchrornatography，ionexchangechrorrratographyandadsorptionchromatography)，membraneseparation(e.g.ultrafiltration,nanofiltrationandreverseosmosis)andbiologicalmethod.Xylooligosaccharidesarepurifiedmainlybymembraneandchromatographytechniques.Themainmethodsofisolationxylooligosaccharidesaregelfiltrationchromatographyandadsorptionchramatogxaphy.KeywordsXylooligosaccharides,Isolationandpurification,ChromatographyMembraneseparation低聚木糖是目前世界上颇受关注的功能性低聚糖之一[1]，低聚木糖是由2-9个木糖以β-1,4糖苷键连接而成的低聚糖，它除了具有低热、稳定、无毒等特性外，还具有独特的生理功能。其制备一般是由天然原料如秸秆、玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳等经预处理及酶水解后，得到富含低聚木糖的酶解液。目前利用最成熟的低聚木糖分离提纯技术有层析分离和膜分离技术，此外还有生物发酵法。我国低聚木糖的产量和纯度与国外相比差距很大，其中主要的技术难题之一就是低聚木糖的分离提纯，目前还没有既经济又有效的分离纯化方。法。因此，利用先进的分离技术如层析技术和膜分离技术改进低聚木糖的分离纯化工艺，以提高产品质量和降低生产成本是目前研究的重点和热点。同时，随着低聚木糖研究工作的开展，木二糖一七糖标准品的缺乏使得低聚木糖的研究工作受到了严重影响，因此，探索低聚木糖单一组分分离纯化的工艺，以制备分离出低聚木糖单一组分(木二糖一木七糖)用作分析标样，同时用于低聚木糖单一组分生理活性的研究无疑都具有重要的意义。低聚木糖的层析分离凝胶过滤层析凝胶过滤层析被广泛应用于低聚糖及其降解产物的分离和分析。在常见的几种凝胶(葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酞胺凝胶)层析分离技术中，聚丙烯酞胺凝胶(Bio-Gel)层析是低聚糖分离的主要技术之一[2]。凝胶层析中用于低聚糖分离较多的凝胶是聚丙烯酞胺凝胶Bio-GelP-2。Bio-GelP-2在20世纪70年代就曾用于低聚木糖的分离[3,4]，后来也出现了许多关于Bio-GelP-2对低聚木糖进行分离的研究报道[5-7]。张军华等利用Bio-GelP-2将低聚木糖混合液分离成至少6个组分，又利用Bio-GelP-4得到木二糖纯度约为97％，木三糖的纯度约为94％。洪枫〔8〕等利用Bio–GelP–4成功分离低聚木糖混合样品，得到木二糖至木五糖单一组分分。Remco在纯化阿拉伯糖基木聚糖降解液实验中，采用Bio–GelP–2凝胶柱，用0.15mmol/1NaN为洗脱剂，收集到7个组分，其中两个组份是木糖和木二糖，再分离可得到较纯组分。Hyeon–JinSun等通过串联使用聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-4和ToyopearlHW–凝胶柱，以蒸馏水洗脱，可将聚合度从2到15低聚木糖单一组分分离。Yasushi〔9〕等研究木聚糖酶对低聚木糖作用方式实验时，采用Bio–GelP–2为介质层析柱，得到木二糖单一组分。此外，还有采用葡聚糖凝胶（SephadexG–15）和琼脂糖凝胶（Sepharose4B）用于低聚糖分离和进行定量或定性报道〔10-11]。张培刚〔12〕等采用SephadexG–25进行分离，结果得到木二糖纯度高达95.63%，得率为6.84%；而木三糖含量很低，仅为0.22%。凝胶过滤层析具有以下优点：（1）多以水为洗脱液，不会导致糖液二次分离纯化；（2）可分离分子量范围很大组分，根据不同需求可采用不同凝胶树脂。缺点：（1）凝胶树脂价格十分昂贵，考虑大规模工业生产时成本问题，不太适合；（2）凝胶树脂不易保存，对流量、压力等有限制，如P–6不适于较高柱压和大流速；（3）本质上只要选择不同分离范围凝胶树脂就一定能将不同分子量组分分离，但实际操作时需选择正确进样量和流速，且分离时间非常长。离子交换层析凝胶层析用来分离同系物是很好的方法，但是由于凝胶层析价格十分昂贵，对压力和流量有限制，分离时间慢长。因离子交换作为一种绿色环保、高效的分离纯化技术，近些年来被广泛应用于功能性成分的提取分离以及研究的开发中。隋明[13]利用树脂色谱（Na+）在流速5BV/h，温度60℃;最佳解吸条件:洗脱液为体积分数10%的乙醇溶液，洗脱流速为3BV/h。在此条件下分离得到木二糖总纯度达到4.66%，总得率认到28.65％；吸附层析活性炭柱层析技术早在20世纪40年代初就用于糖类分离。Howard早在1957年就用活性炭分离戊聚糖，用不同浓度乙醇溶液洗脱，木二糖和木三糖用乙醇重结晶法得到晶体。石波〔14〕用活性炭分离低聚木糖，用乙醇作为洗脱剂，得到木二糖至木六糖的单一组分，最后得到木二糖纯度≥98%。离子交换吸附层析具有以下优点：（1）效率高，树脂柱操作可达到数千个理论塔板数，能完成高效分离；（2）操作方便、占用空间小、易于自动化；（3）性价比，树脂可长期反复使用，只消耗普通再生药剂，经济效益高。缺点：品种多、性能差别大、对不同物质吸附能力不同，筛选时间长；与活性炭相比，具有吸附量大、适用范围广等优点。低聚木糖的膜分离膜分离技术是一种新兴的高效分离、浓缩和提纯技术，由于该技术具有常温、无相变、高效、节能、无污染等特点，因此，近30年来在食品加工、医药、生物化工等领域获得了较大发展。膜分离技术主要分为微滤(MF)、超滤(uF)、纳滤(NF)、反渗透(RO)、透析(DS)、电渗析(ED)和渗透汽化(PV)等。用于低聚糖分离的膜技术主要有超滤、纳滤和反渗透。超滤可去除大分子物质或固体微粒，根据其膜孔径的大小，还可用于低聚糖的分级分离。Mitsuro等[15]利用截留不同分子质量的超滤膜对低聚木糖进行了分级处理，分析结果显示，截留分子质量小于500的膜所得级分主要为木糖和木二糖，截留分子质量大于500而小于1000的膜所得级分为木四糖和木五糖，截留分子质量大于1000而小于5000的膜所得级分主要为木七糖和木八糖。Waniskca等[16]也曾将超滤膜PM10,UM10和UM2用于玉米糖浆DP5-10和10-20的分级分离研究。纳滤在过滤分离时，能在截留小分子有机物的同时，透析出盐，即集浓缩与透析为一体。Urano等[17]对纳滤膜用于低聚糖分离的规律进行了研究，并将4种不同的纳滤膜(GS,G10,G20,G50)对从耶露撒冷洋蓟中提取的低聚果糖进行了分离，结果表明，G50能除去分子质量大于10OOODa的大分子，其它三种纳滤膜能将低聚果糖按分子质量的大小依次分离。从母乳中除去乳糖以纯化活性低聚糖的传统方式是凝胶过滤层析，此法处理量小，处理时间长。Douglas等将脱脂母乳用S半乳糖普酶将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖后，利用纳滤膜纯化，经过四次循环低聚糖的收率超过50%，此法还可推广到羊乳中三糖、四糖的分离纯化。Athanasios等[18]研究了两种纳滤膜(NF-CA50和NF-TFG50)和一种超滤膜(LJRCA1)对单糖、低聚糖的分离特性，结果表明两种纳滤膜可有效分离单糖和二糖，其中NF-TFG50纳滤膜用于低聚糖混合物分离时可除去81%的单糖而保留88%的低聚糖，其分离特性满足低聚糖分离纯化的要求。超滤膜UF-CA1在除去88%单糖的同时会损失47%的低聚糖，其分离效果不理想。超滤一纳滤两种膜技术结合用于低聚糖的分离纯化也较为广泛。Yasuhito等[19]研究了超滤-反渗透和超滤一纳滤两种回收大豆低聚糖的方案,分析表明纳滤膜所回收的大豆低聚糖质量高于市售产品，而且其浓缩效好于反渗透。因此他得出结论，采用超滤-纳滤法回收大豆低聚糖较为可取。低聚木糖的生物发酵分离除常规的理化分离方法外，还可通过生物发酵法将功能性低聚糖中的非功效组分选择性除去。Isao等[20]利用酵母(Candidaparapsiosisvar.komabaerisisK-75)在30e条件下发酵木糖和木二糖的混合溶液215d后，可将混合液中的木糖选择性发酵而去除，离心除去酵母后便得到了纯化的木二糖溶液。江正强〔21〕等将重组海栖热孢菌（Thermotogamaritime）极耐热木聚糖酶B固定于镍螯合环氧载体EupergitC250L（固定化XynB）上，水解玉米芯生产木二糖，水解15批次后仍保持92%水解活性，水解液含有49.8%木二糖。其他方法化学方法也可获得木二糖，如张艳敏〔22〕等采用乙酸乙酯对低聚木糖糖浆除杂，用不同浓度乙醇溶液进行分离纯化，能分离出纯度较高木二糖。据李鑫专利介绍（CN200910025093.2），10~200g/L木二糖溶液，加入1-80g无机盐和0.67~19L有机溶剂，结晶温度控制在10℃~40℃进行结晶可得到木二糖。问题和展望尽管近年来低聚木糖的生产技术取得了较大的进展，而其分离提纯技术一直没有取得更大的突破，主要存在色泽深、产品纯度难以提高或提纯需成本过高等问题，因此低聚木糖的分离纯化是其成本过高的主要障碍。而随着先进膜产品和层析填料的研究与开发，膜技术及层析技术用于低聚木糖的分离纯化必将是以后高效低能提纯低聚木糖的有力措施。在低聚木糖生产和应用研究过程中，需要低聚木糖单一组分的标准样品用于低聚木糖的分析。而低聚木糖各单一组分除分子质量有所差别外，其它理化性质都比较接近，导致单一组分分离困难，结果导致市场上低聚木糖的标样缺乏，部分产品售价较高。以目前市场上仅有的木二糖为例，其售价竟高达2000元人民币每mg，合40万元每g。根据低聚木糖单一组分的理化特性，除采用层析分离技术外，目前尚无其它更为有效的分离方法，适于低聚木糖单一组分制备分离的层析技术主要有凝胶过滤层析和吸附层析两种。两种层析分离技术各有优缺点，凝胶过滤介质较昂贵，但可反复使用，一般用水作为洗脱剂等度洗脱;吸附层析所使用介质相对便宜，样品容量大，但不能采用等度洗脱的方式，不能用示差检测，而且周期比较长。随着生物工程下游技术的迅速发展，高效的低聚木糖分离纯化的工艺、技术和设备的出现，人们必将开发出高效的低聚木糖分离提纯工艺，这对于提高功能性低聚木糖产品质量、提高生产效率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。而低聚木糖单一组分的制