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质粒载体载体噬菌体载体动物病毒载体大肠杆菌质粒载体pBR322单链DNAM13载体SV40载体乳头瘤病毒载体昆虫杆状病毒载体柯斯(COS)载体λ噬菌体载体枯草杆菌质粒载体pNC3酵母菌质粒载体2μ农杆菌Ti质粒载体Ti一基因工程的基本元件------载体四、E.coli质粒载体1.pBR322是基因工程中最重要的一个人工质粒,有万能质粒之美称.①pBR322的构建a)复制子:松弛型b)选择标记:Amp、Tetc)筛选形式:抗性插入失活d)单一切点:24个③物理图谱②pBR322的特性pBR322plasmidF.BolivarR.L.RodriguezBacterialResistancepBR322酶切图谱2.pUC系统美国加利福尼亚大学的科学家J.Messing和J.Vieria于1987年首先构建①来自pBR322质粒的复制起点②氨苄青霉素的抗性基因③大肠杆菌β-半乳糖酶基因的启动子及其编码的α-肽链基因（lacZ’）④位于lacZ’基因内的一段MCS区段2.pUC系统X-gal溴氯吲哚+β-半乳糖苷-----蓝白斑筛选插入片段无酶活性白斑未插入片段有酶活性蓝斑β-半乳糖苷酶3.TA载体经TaqDNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A酵母菌质粒载体①食品级微生物②适合于真核基因表达③基因产物外分泌七、酵母菌质粒载体多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主复制功能区域（ARS片段）。整合型、复制型、附加型和稳定型等类型。①含有E.coli质粒的复制起始序列。②含有酵母的筛选标记（如LEU2）③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。2.酵母菌质粒载体的特点1.酵母菌质粒载体的类型TypeNameDescriptionbacterialoriginColE1ColE1(pUC-type)originofreplicationpromoterGal1-10promoterGal1-10yeastpromoterselectablemarkerampRampicillinresistancegeneselectablemarkerchlRchloramphenicolresistancegeneLOSTinrecombined(withinsert)formselectablemarkerURA3URA3auxotrophyselectablemarker(yeast)yeastcentromereCEN4yeastcentromericsequenceyeastoriginARS1ARS1yeastoriginofreplication④酵母菌稳定型质粒载体着丝粒第二节噬菌体载体一、λ噬菌体载体1.λ噬菌体结构特点:①线性双链DNA分子②可在E.coli中大量繁殖③具非必需区(约1/3长度）④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端λ噬菌体线性DNA分子的粘性末端及其环化作用（a）具有互补单链末端（粘性末端）的λDNA分子。（b）当进入宿主细胞后，通过粘性末端之间的碱基配对作用实现的线性分子的环化作用，由此形成的双链区叫做cos位点GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG5’-P5’-P3’3’粘性末端环化作用（a）（b）2、λ噬菌体的缺陷与改造λ噬菌体的缺陷：⑴酶切点太多5个BamH1位点，6个BglⅠ位点，5个EcoRⅠ位点。⑵野生型只能接纳一定长度的DNA。λ噬菌体的75-105%，只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。λ噬菌体的改造：⑴切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（15-23Kb）；⑵去除过多的酶切位点，每种酶只留1-2个切口；⑶增加选择标记基因（selectablemarker）；⑷建立λDNA的体外包装。主要外壳蛋白质是基因E的产物头部前体连环DNA基因A的产物在cos位点切割噬菌体DNA包含在外壳中的基因D的产物基因W和FII的产物组装蛋白质加完整的尾部噬菌体的包装过程sup-细菌头部基因（琥珀突变型）尾部基因（琥珀突变型）转录复制蛋白质合成组装尾部所需要的组分“无头部”的提取物组装头部所需要的组分“无尾部”的提取物温育完整的噬菌体转录复制蛋白质合成T4噬菌体的体外包装λDNA的体外包装体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍4.凯伦噬菌体载体克隆过程5.λ噬菌体载体优点:用途:主要用于建立真核生物的基因文库①感染高效:比质粒高百倍②容量大:可达15Kb(不得超过原来长度的105%,不得短于原来长度的75%)③易操作,易保藏二、柯斯(COS)载体(cosmid)1.柯斯载体的组成①带有抗药性标记②带有质粒的复制起始点③带有多个限制酶的单一切点④带有λ噬菌体粘性末端片段由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。2.柯斯载体的特点3.cosmid载体的优点①能象λDNA一样体外包装，并高效导入受体细胞②可以装载比质粒或λDNA大得多的外源DNA片段cos区1.7kb+质粒部分3.3kb46.5Kb外源DNA③由于携带质粒的选择标记，便于筛选④由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序三、M13噬菌体克隆载体1.M13的特性:环状,单链DNA,6.407Kb2.M13噬菌体作为载体优越性①单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式的DNA简称RFDNA；②不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；③单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的大小制约的，不存在包装限制问题；④可产生含外源片断的单链DNA分子。2.M13载体的构建五、噬菌体展示载体其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因PⅢ中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体克隆DNA大片段±*++-构建基因组文库-++-构建DNA文库+---常规的亚克隆化+---构建新型的DNA结构+---序列分析+--+单链探针---+外源基因在大肠杆菌中的表达+---*外源DNA如超过10kb，则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低四种常用载体的比较