基因工程3-3基因操作的工具酶

3.3DNA聚合酶DNA聚合酶：能够催化脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的游离3’-OH末端，使核苷酸发生聚合作用，而不从模板上解离。反应特点：(1)以四种三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）为底物(2)反应需要模板的指导，加入的核苷酸由模板链所决定(3)聚合反应需要有引物存在，且引物要有3’-OH游离基团(4)DNA链的生长方向为5’3’(5)产物DNA链的性质与模板相同（半保留复制）DNA聚合酶只能在已有的核酸链上延伸DNA链，而不能从无到有开始DNA链的合成。种类：到目前为止，已从E.coli中发现了PolI、PolII、PolIII三种DNA聚合酶。其中PolI和PolII的主要功能是参与DNA的修复过程，PolIII与DNA的复制有关。三种聚合酶中，只有PolI同分子克隆关系密切。3.3.1大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNAPolI）DNAPolI是从大肠杆菌细胞中分离得到的，该酶是由单一多肽组成的球蛋白，MW=109000，直径=65ÅDNAPolI已得到高度纯化，从100kg大肠杆菌中可以分离到约500mg纯化的酶蛋白。每个成熟的大肠杆菌细胞中约有400个分子的PolI。1.DNAPolI在空间结构上有三个位点：(1)DNA模板结合位点——结合模板(2)核苷酸-磷酸结合位点——结合引物(3)dNTP结合位点——结合底物2.DNAPolI是一种多功能酶：(1)5’3’的聚合酶活性催化单核苷酸逐个地结合到DNA模板的3’-OH末端，沿着引物的3’-OH方向按模板顺序从5’3’延伸。每分子DNApolI每分钟可以催化约1000个核苷酸的聚合。(2)5’3’的外切酶活性只作用于双链DNA（dsDNA），从5’端切割下一个个单核苷酸。(3)3’5’的外切酶活性能从游离的3’末端降解单链DNA（ssDNA）成为单核苷酸，通常对双链DNA不作用。在正常聚合条件下，该酶对dsDNA的3’5’外切酶活性受到5’3’聚合酶活性的抑制。但一旦出现错配碱基时，聚合反应立即停止，由3’5’外切酶迅速除去错误进入的核苷酸，然后聚合反应才得以继续进行下去。所以3’5’核酸外切酶活力被认为起着校对功能，对DNA复制的忠实性极为重要。3.E.coliDNAPolI在基因工程中的用途:(1)可用于填补dsDNA上的缺口，以便有效地进行DNA重组(2)用于DNA序列分析(3)用于制备DNA探针在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸后，聚合作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸。随着反应的进行，5’一侧的核苷酸不断地被移去，3’一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动——缺口平移（NickTranslation）。应用缺口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是：在25l总体积中含有1g纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseI、polI、32PdNTP和未标记的dNTP。脱氧核糖核苷酸酶I（DNaseI）是一种内切酶，它能够水解单链或双链DNA，形成带有5’-磷酸末端的单（寡）核苷酸。由于32PdNTP比较昂贵，所以一般都采用低浓度的32PdNTP（2mol/L）和高浓度的未标记的dNTP（20mol/L）。而且就大多数实验的要求，使用一种32PdNTP就足够了，其他3种均可采用未标记的dNTP，或是用适量的未标记的dNTP稀释每种32PdNTP。改变反应体系中DNaseI的数量，可以控制32PdNTP的参入程度，一般希望有30%左右的32PdNTP参入DNA链。3.3.2大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（E.coliDNAPolIKlenowfragment）用蛋白酶将DNAPolI作有限水解，可得到分子量为75000dal和36000dal的两个片段，大片段即称为Klenow片段，它具有5’3’的聚合酶活性和3’5’的核酸外切酶活性，但失去了全酶的5’3’的核酸外切酶活性。Klenow聚合酶可以标记DNA片段末端（5’延伸末端）。对于限制性核酸内切酶EcoRI切割后形成的5’延伸末端可用32PdATP标记：而BamHI切割后形成的5’延伸末端可用32PdGTP标记：3.3.3T4DNA聚合酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中分离纯化的一种特殊的DNA聚合酶。1.T4DNA聚合酶也是一种多功能酶：(1)5’3’的聚合酶活性(2)3’5’的外切酶活性其外切酶活性比E.coliDNAPolI的活性高200倍。(3)取代反应活性如果在反应混合物中仅存在一种dNTP，则此酶的3’5’外切酶活性将从dsDNA的3’末端降解，直到互补于这个dNTP的碱基出现为止，然后在这一位置发生取代反应。2.T4DNA聚合酶在基因工程中的应用(1)以填充反应标记带有5’延伸末端的dsDNA片段(2)将DNA的3’延伸末端切成平末端(3)以取代反应标记带有3’延伸末端或平末端的dsDNA片段(4)以部分消化dsDNA法标记DNA片段作为杂交探针（链特异的探针）3.3.4逆转录酶是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA称cDNA，即互补DNA。1.逆转录酶也是一个多功能酶：(1)RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’3’方向合成DNA链。几乎所有真核生物的mRNA分子3’末端都有一段PolyA，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。(2)DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3’-OH末端的DNA片段为引物，沿5’3’方向合成DNA链。可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。(3)外切RNA酶活性底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：*从RNA链5’末端外切：称5’3’外切RNA酶*从RNA链3’末端外切：称3’5’外切RNA酶2.逆转录酶在基因工程中的应用：主要用途是转录真核生物的mRNA成为cDNA，从而制备基因片段。3.商品化的逆转录酶有两种：(1)禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶(2)Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶AMV逆转录酶虽能更有效地拷贝复杂的mRNA，但它有很强的外切RNA酶活性。而Mo-MLV逆转录酶的外切RNA酶活性较弱，更有利于制备全长的cDNA。两种逆转录酶均无3’5’外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。3.4DNA和RNA的修饰酶3.4.1核酸酶SI1.作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillusoryzae）中提取的，可降解ssDNA或ssRNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或小裂缝（gap）处降解dsDNA。2.作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5，这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。3.在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。(1)切除单链粘性末端，产生平末端，再用T4连接酶连接。(2)切除cDNA的发夹结构。3.4.2末端脱氧核苷酸转移酶1.作用特点：此酶是从小牛胸腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3’-OH末端上，不需要模板，其引物是带3’-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA只有CO2+存在时才能作引物。2.在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）。3.4.3外核酸酶III1.作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3’-OH末端降解产生5’单核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的应用：(1)产生具有5’延伸末端的DNA片段(2)制备特异的DNA探针3.4.4外核酸酶Bal311.作用特点：此酶是从乳白短杆菌（Brevibaceriumaldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3’，5’两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段。底物可以是带延伸末端或是平末端的dsDNA，对3’、5’两端的降解速度相同。2.作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal31失活。3.在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失。3.4.5T4多核苷酸激酶1.作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的。能催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’-OH末端上。2.在基因工程中的应用：可用于缺乏5’-磷酸的待连接DNA片段的5’端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5’-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5’-磷酸化。3.4.6碱性磷酸化酶（碱性磷酸酯酶）1.作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP，从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5’-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。2.在基因工程中的应用：(1)在用32P标记DNA的5’末端之前，除去磷酸。(2)在DNA重组技术中，除去DNA片段的5’-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上。