基因工程原理

第六章基因工程原理第一节基因工程的概念及其主要内容第二节基因工程中的工具酶第三节基因克隆的质粒载体第四节目的基因的分离第五节基因与载体的重组与导入受体细胞第六节重组体的筛选第七节目的基因的表达第一节基因工程的概念及其主要内容一、基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(geneengineering)常和以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程技术及其应用供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断转基因动物(畜牧业、渔业生物反应器)转基因植物(农业、林业生物反应器)冶金、环保轻工、食品转基因植物转基因动物作为生物发生器基因本身也是一个产业Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）蛋白质工程的概念在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。蛋白质工程主要内容主要目标蛋白质氨基酸序列的分析蛋白质晶体结构分析蛋白质功能预测和分析蛋白质组分析酶工程的概念是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别是利用DNA操作技术，修饰改造酶分子的结构或活性位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。酶工程的主要内容酶的分离纯化酶与细胞的固定化技术及反应器酶制剂的发酵生产酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶抑制剂与激活剂开发与研究人工设计与合成模拟酶及酶分子发酵工程概念发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。发酵工程技术发酵对象：传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物细胞培养、植物细胞培养发酵类型：液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式发酵发酵技术设备生物技术的应用领域医药：生物制药；基因治疗；人工器官农业和畜牧业转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、高品质新品种转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶环境污染治理；废物利用；污染物生物降解生物技术产业化生物技术产业：利用细胞和生物分子进行药品、农产品生产开发和环境治理的产业，该产业技术由医药生物技术、农业生物技术和环境生物技术共同组成医药生物技术重点攻克癌症、艾滋病、老年痴呆症、帕金森病、心脏病、糖尿病等危害人类的顽疾农业生物技术着眼于提高农产品的产量和质量。环境生物技术重点用于清除危险废弃物生物制药产业化特点高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透高投入：在国外，一个生物药品平均要投入1~3亿美元，并随着开发难度的增大,有逐步增高的趋势长周期：国际上，一个新的生物药品需要6~8年时间高风险:一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、I~III期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃高回报:开发成功一个新的生物药品,回报很高。如美国Amgen公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到1997年的销售额分别接近和达到20亿美元基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg美国生物技术产业发展情况0100200300400500产值（亿美元）19801991199619972000年份美国生物技术产业发展情况美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类产品数量疾病种类产品数量感染性疾病39心脏病26神经系统疾病28呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病19皮肤病19移植13消化系统疾病11遗传疾病11血液疾病9糖尿病及并发症7不育症5眼病3生长发育不良症3骨质疏松2妊娠预防2肿瘤疾病175基因治疗人数情况010002000300040005000人数199419962000年份基因治疗个案生物技术产业化—农业领域已有35个科120多种植物获得转基因植物，一些重要的农作物获得商品化的转基因品种。种植面积迅猛发展。采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。植物反应器生产稀有蛋白。世界转基因作物大田释放情况(1987.1-1998.4)转基因作物特性批准项数所占比例抗除草剂129729.6%抗虫104623.8%提高产品质量88620.2%抗病毒4369.9%改善农学性状2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%总计4387100%转基因作物种植面积00.511.522.533.54千万公顷19951996199719981999年份全世界转基因作物种植面积生物技术与传统中药中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分中药临床药效的科学评价与分析方法生物技术的应用中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因表达（蛋白质）的影响。技术平台：大规模基因表达分析（基因芯片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、动力学。技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术中药新剂型第二节基因工程中的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途（一）、限制修饰系统的种类1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。（二）、限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)（三）、限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG（五）、限制酶的用途1.DNA重组2.限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47—108kD。酶切图谱的构建（a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱酶切图谱的构建（b）二、DNA甲基化酶（一）、甲基化酶的种类与识别顺序1