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基因工程原理与技术授课教师：参考书：1、《基因工程原理》吴乃虎主编2、《植物基因工程原理与技术》王关林主编第一章绪论第一节基因工程的概念基因工程(geneengineering)是现代生物技术的核心内容。基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组)。基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。第二节基因工程的诞生与发展基因工程诞生于1973年。一、基因工程诞生的理论和技术基础1、理论基础①DNA是遗传物质；②DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；③遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2、技术基础①限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；③基因工程载体的构建与应用。二、基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组的DNA体外重组实验。1973年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。(见下两张幻灯片)同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973年被定为基因工程诞生的元年。pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平板三、基因工程的发展分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛发展阶段。1、基因工程的艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统的安全性改造)基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2、基因工程的逐渐成熟阶段(1976~1982，基因工程药物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下图)；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体从动物脑中提取5mg---50万只羊脑9升工程大肠杆菌培养液3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗)发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。1982年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。1991年，美国提出人类基因组计划并实施。4、鼎盛发展阶段(21世纪)2005年完成人类基因组计划。至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来,至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达50多种。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市。虽然转基因动物比转基因植物诞生早，但其发展比转基因植物要慢得多！主要原因是动物转基因技术操作烦琐、困难，动物细胞培养要求高，不易再生出个体。荷兰的GenPharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白，预计每年从牛奶生产出来营养奶粉的销售额是50亿美元。英国罗斯林研究所研制成功的转基因羊，其乳汁中含有α[1]-抗胰蛋白酶，可治疗肺气肿病。这种病在北美比较常见，病人以前只能依赖于注射人的α[1]-抗胰蛋白酶做替代疗法，价格昂贵，而现在用转基因羊来生产，每升这种羊奶可售6000美元。中国工程院院士曾溢涛教授研究小组获得5只转基因山羊。其中一只奶山羊的乳汁中，含有堪称血友病人救星的药物蛋白——有活性的人凝血因子Ⅸ。第三节基因工程研究的主要内容一、基因工程研究的主要内容主要包括：基础研究（载体的研究、受体系统的研究、目的基因研究、工具酶的研究、转化方法的研究、生物基因组学研究）和应用研究等。1、载体的研究构建各种用途载体及提高外源基因表达的效率。2、受体系统的研究包括细菌、真菌、植物、动物。受体系统的安全性及转化效率。3、目的基因研究目的基因的分离、克隆及改造。4、工具酶的研究开发新的工具酶。5、转化方法的研究开发各种受体细胞的高效转化方法。6、生物基因组学研究具有重要经济价值的各种生物的基因组测序、挖掘新的基因等。7、应用研究包括基因工程药物研究、基因疫苗研究、转基因植物研究、转基因动物研究以及在酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等方面的应用。二、基因工程的基本操作程序①分离获得带有目的基因的DNA片段及载体选择与构建。②限制性核酸内切酶分别切割外源DNA和载体。③通过DNA连接酶将外源基因DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。④将重组DNA分子引入到受体细胞(转化)。⑤带有重组体细胞(转化体)的扩增及选择培养。⑥转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。⑦目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达(基因功能研究或基因改造研究)。三、基因工程的基本操作内容基因工程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达。为达到此目的，可从以下几个方面进行操作。①选用高拷贝载体，增加外源基因在受体细胞中的剂量；②筛选、修饰和重组启动子、增强子、终止子等基因的转录调控元件，并将这些元件与外源基因精细拼接，强化外源基因的转录水平。③选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控元件，强化受体细胞中蛋白质的生物合成过程。④构建融合表达载体或分泌表达载体，增加外源蛋白的可溶性。第四节基因工程的意义与发展前景一、基因工程研究的意义①大规模生产其他生物体内含量极微但却具有较高经济价值的生物分子；②设计构建新物种(新性状乃至全新物种)；③搜寻、分离和鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源(基因)。二、基因工程发展前景基因工程问世以来短短的三十年，显示出了巨大的活力，基因工程的前景将更加灿烂辉煌。今后，基因工程的重点研究方向是基因组学、基因工程药物、动植物生物反应器和环保等方面。第二章基因工程的工具酶工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。第一节限制性核酸内切酶一、宿主的限制-修饰现象(见下图)限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰作用(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。R/M系统①DNA甲基化酶②限制性核酸内切酶R/M系统的作用①限制作用②修饰作用1953年，Arber发现限制-修饰现象，预见限制性核酸内切酶的存在；1970年，H.O.Smith从流感嗜血杆菌中分离出第一个II型限制性核酸内切酶HindII。Nathans首次用限制性酶切割SV40DNA。根据限制-修饰系统的遗传分析，大肠杆菌K12有以下4种表型：①rk+mk+：野生型，具有完整的限制和修饰功能。②rk-mk+：限制缺陷型，不能降解外源DNA，但具有修饰功能，这类突变株经常用于基因工程的受体。③rk-mk-：限制和修饰缺陷型，既无限制功能，又无修饰功能，也常用于基因工程的受体。④rk+mk-：修饰缺陷型，缺乏修饰自身DNA的功能，但具有限制功能，故也称为“自杀性表型”(suicidephenotype)。二、限制性核酸内切酶的类型限制性核酸内切酶是指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。简称限制性内切酶或限制性酶，目前已经鉴定出三种不同类型。至今，已发现近4000种限制酶。特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构功能辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例异源三聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列距识别序列1kb处随机性切割无EcoK、EcoB同源三聚体限制Mg2+4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割广泛EcoRI、HindIII…异源二聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列识别序列下游24-26bp处随机性切割小EcoPI三、限制性核酸内切酶的命名1973年H.O.Smith和D.Nathams提出命名系统，1980年Roberts在此基础上进行了修改。①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆菌d株HindⅡHindⅢ四、II型限制性核酸内切酶的基本特性1、II型限制性内切酶的识别序列一般为4～6bp的回文序列。也有6bp以上的，如NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列)，如SfiI。有些II型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如HindII可识别4种核苷酸序列。酶识别序列酶识别序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG2、II型限制性核酸内切酶的切割方式大多数II型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。有三种切割方式：①在识别序列的对称轴的5’末端切割，产生5’黏性末端，如EcoRI②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，如PstI③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如PvuII有些识别序列为间断型回文序列的II限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：BglIGCCNNNN↓NGGCSfiIGGCCNNNNN↓NGGCCXmnIGAANN↓NNTTC有极少数II型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如MboII识别GAAGA序列，切割位点则是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。如：HpaII与MspI的识别序列和切割位点都相同(C↓CGG)，但MspI还可以识别已甲基化的序列CmCGG；SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)，识别序列相同，但切割位点不同。同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)BglII(5’-A↓GA