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基因工程及分子生物学大实验邢万金苏慧敏内蒙古大学生命科学学院生物系一、实验目的学习基因操作的基本技术熟悉基因克隆常规仪器的使用学习科研项目的开题论证培养科学实验的独立操作能力建立做好原始实验记录的习惯练习撰写研究论文二、教学组织学生自主设计方案教师审查方案可行学生独立实验操作教师现场巡回指导学生失败互相救助教师把关实验结果三、实验内容目的基因的亚克隆、表达载体的构建、在大肠杆菌中诱导表达。1.目的基因纳豆激酶成熟肽（NK）（原核）位于pMD18-T-NK(full)绿色荧光蛋白（EGFP）（真核）位于pEGFP-N1上红色荧光蛋白（DsRed2）（真核）位于pDsRed2-1上其它基因（教师在研课题）pMD18-T-NK(full):3.8kp纳豆激酶全长1181bpDNA已插入pMD18-T2.载体pMD19-T（TA克隆）pUCm-T（TA克隆）pET-Trx（融合表达）pGEX-4T1（融合表达）克隆载体：表达载体：pMD18/19-TpUCm-TpET-Trx3.3kbAmpPT7RBSTRX(his-patch)CTCGAAGTTCTGTTTCAGGGTCCAGCAGGATCCGCAGAATTCAGCGCTAGCTAACATCATCATCATCATTAAGCTTLeuGluValLeuPheGlnGlyProBamHIEcoRINheIHindIIIBamHIEcoRINheIstopHindIIIP3CcutsitepGEX-4T1pGEX-4T1~4950bpBamHIEcoRISmaIXhoISalINotIGTCGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCCCGGGTCGACTCGAGCGGCCGCATCGTGACTGALeuValProArgGlySerProGluPheProGlyArgLeuGluArgProHisArgAspThrombine四、实验流程提取目的基因模板提取表达载体质粒PCR扩增目的基因EcoRI+BamHI双酶切回收T载体目的基因亚克隆载体EcoRI+BamHI双酶切回收目的基因片段目的基因表达载体IPTG诱导表达酶切鉴定酶切鉴定SDS-PAGE检测感受态DH5α感受态BL21(DE3)参考计划观察，转入清水，照相下午灌胶加样电泳，染色45min，脱色过夜上午第九天OD600=0.5时诱导表达3h，离心集菌下午早晨7：00摇菌[包括空BL21（DE3）]，练习组装SDS电泳模具上午第八天讲解实验论文写作要求下午提重组表达载体质粒，酶切验证，转化BL21(DE3)，涂平板过夜上午第七天挑重组表达载体转化克隆，摇菌过夜下午作感受态BL21(DE3)上午第六天摇BL21(DE3)下午“目的基因-表达载体”连接液转化DH5a，涂平板过夜上午第五天回收目的基因片段，与表达载体连接过夜下午提重组T载体，EcoRI和BamHI双酶切验证上午第四天挑重组T载体平板克隆，摇菌过夜下午上午第三天“目的基因-T载体”连接液转化涂板，回收pET-Trx，下午作感受态DH5a，EcoRI和BamHI双酶切并回收表达载体上午第二天PCR扩增目的基因，然后与克隆载体连接过夜，倒平板，摇DH5a下午提质粒（表达载体和目的基因模板质粒）上午第一天讲解仪器，发放移液器等，摇菌管和培养皿灭菌，摇表达载体和目的基因菌第零天下午实验一质粒DNA的小量制备（1）提取目的基因载体（作PCR模板）pMD18-T-NK(full)pEGFP-N1pDsRed2-1（2）提取表达载体pET-Trx（备酶切）pET-TrxpGEX-4T1实验二质粒DNA电泳鉴定实验三质粒DNA的酶切37℃实验四PCR扩增制备目的基因ddwater32μl10×PCRbuffer（不含MgCl2）5μl25mMMgCl23μl2.5mmol/LdNTP4μl10μmol/LPrimer12μl10μmol/Lprimer22μl模板质粒1μl3U/μlTaq酶1μl（3u）总体积50μl1.PCR体系2.PCR仪的循环程序设置：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min30s⑤goto②34cycles⑥72℃10min复性温度比引物的Tm值低2-5℃。3.PCR产物电泳实验五从琼脂糖凝胶中回收DNA片断表达载体T载体目的基因EBEBnoEB表达载体BamHI+EcoRIT载体+目的基因BamHI+EcoRI实验六目的基因片段与载体连接表达载体BamHI+EcoRI目的基因BamHI+EcoRI重组表达载体T4ligase，14℃目的基因（PCR产物）T载体重组克隆载体14℃实验七感受态菌的制备DH5a和BL21（DE3）4℃实验八细菌转化42℃重组载体感受态菌37℃37℃实验九转化克隆的筛选和鉴定提取质粒酶切37℃37℃电泳鉴定结果载体目的基因PCR产物重组载体滞后BamHI+EcoRI实验十外源基因的诱导表达OD600IPTG实验十一SDS-PAGE检测表达蛋白1.低分子量蛋白Marker2.BL21(DE3)对照3.BL21(DE3)诱导4-8.重组表达载体诱导9.表达载体诱导20.1314366.297.4123456789