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基因工程技术：按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型。质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中，它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝。质粒的不相容性：利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。从细胞中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。溶菌酶：破坏菌体细胞壁；SDS和TritonX-100：使细胞膜裂解。染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。基因组DNA的提取植物基因组DNA提取：提取缓冲液（Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS），氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA，异丙醇—沉淀DNA（提染色体），TE（Tris.Cl,EDTA）--溶解DNA，RNase—保存液，降解RNA，NaAC—加盐，70%乙醇—漂洗。细菌基因组DNA提取：SDS，蛋白酶K，氯仿：异戊醇（24：1）--沉淀DNA，苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）--抽提，70%乙醇—漂洗，TE,NaCl—调节离子强度，RNaseA，CTAB/NaCl溶液—CTAB--一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。总RNA制备mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿：200℃烘2h，塑料器皿：DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。RNA酶抑制剂：DEPC--强烈但不彻底，与氨水溶液混合会产生致癌物；异硫氰酸胍--最有效，使RNA酶失活；其他--RNA酶蛋白抑制剂（RNasin）SDS,尿素等。细胞内总RNA制备方法：异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。（均先将组织在液氮中研磨成粉末）异硫氰酸胍热苯酚法：异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。酚/SDS法：用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。Trizol法：Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）。mRNA提取制备mRNA原理：分离的总RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。（上样buffer和洗脱buffer）。溶液中无盐时要沉淀RNA，必须加盐NaAC。琼脂糖凝胶电泳DNA凝胶电泳：琼脂糖--分离DNA片段大小范围广；聚丙烯酰胺--小片段，分辨力高。琼脂糖凝胶电泳特性：1.DNA分子大小：DNA分子在一定琼脂糖浓度下的迁移率；2.琼脂糖浓度：1.0-1.2%；3.DNA分子构象：超螺旋DNA最快，线状双链最慢；4.电源电压：不大于5V/cm，负—正；5.染料：溴化乙锭（EB）--强诱变剂；6.离子强度：0.5*TBE（不能过高，避免buffer发烫）。RNA凝胶电泳：RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种：乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞（剧毒）琼脂变性电泳。DNA限制性内切酶限制性内切酶：限制性内切酶是指能特异性结合于一段被称为限制性识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。I类酶：结合于识别位点并随机切割识别位点不远处的DNA；II类酶：由二种酶分子组成的二元系统（核酸酶—切割、甲基化酶—修饰），其识别位点和切割位点是同一位置；III类酶：在识别位点之外切割DNA分子，然后从底物上解离。甲基化：保护DNA分子，越活跃的地方，甲基化程度越低。切割性能：回文对称特异核苷酸序列、平末端DNA片段、粘性末端。酶单位：在合适缓冲液和反应温度下，在20ul反应体积中一小时内完全降解1mgDNA所需要的量。载体：把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。常见载体：质粒、λ噬菌体、粘粒、BAC、YAC等。质粒载体的特性：分子量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具有容易操作的检测表型。pBR322、pUC18/19（分子量更小、α-互补原理—蓝白筛选、多克隆位点区MCS）、pBluescriptSK(+/-)（MCS）。乳糖操纵子：α-互补原理：lacZ（β-半乳糖苷酶基因）基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间可以实现互补的现象。蓝白斑筛选：X-gal-----IPTG（乳糖类似物—诱导剂）--------蓝色吲哚产物（当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色）。λ噬菌体：侵染细菌的病毒（裂解性侵染、溶源性侵染）。【碱性磷酸酶--活性好,但较抗热和去污剂,在去磷酸化反应后很难去除】细胞转化（transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段（E.coli）。【如需将质粒载体转移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA.】感受态细胞：受体细胞经一些特殊方法（如CaCl2、RbCl（KCl）等化学试剂）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞状态。【LB培养基不含Amp，设2个对照（防污染）】提高转化效率的因素：细胞生长状态和密度（刚进入对数生长期）、质粒的质量和浓度（DNA溶液体积不超过感受态细胞体积的5%）、试剂质量（最高纯度）、防止杂菌和杂DNA污染（无菌器皿）。PCR技术的3个步骤：变性：目的双链DNA在94℃下解链；退火：两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下雨模板上的目的序列通过氢键配对；延伸：TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。PCR反应5要素：引物、模板、酶、dNTPs和Mg2+引物设计原则：1.引物长度：（20bp）；2.引物扩增跨度：2kb左右最有效；3.引物碱基：G+C含量40-60%为宜，ATGC分布均匀，不要集中；4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补；5.引物3’端的碱基：严格要求配对；6.引物中有或能加上合适的酶切位点；7.引物的特异性：与其他序列无明显同源性；8.扩增产物本身无稳定二级结构（以免产生非特异性）；9.引物量：浓度要控制。模板：可以是DNA或RNA，可以是线状或环状。TaqDNA聚合酶：活性半衰期为92.5℃（最后加入）。dNTPs：质量、浓度与PCR扩增效率有关，应保存得当，不好冻融，最好分装。Mg2+：对PCR扩增的特异性和产量有显著影响，浓度过高，特异性降低，出现非特异性；过低，降低TaqDNA聚合酶活性，使反应产物减少。反应缓冲液：Tris.Cl，KCl，和适当浓度的Mg2+。（BSA、DDT）PCR反应条件：温度、时间和循环次数。温度：变性：94℃，退火：Tm=4(G+C)＋2(A+T)，值约低5℃，延伸：72℃。循环次数：25-30循环。【PCR常见问题：无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性】实时荧光定量PCR技术：技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。检测模式有：Tagman探针和SYBRGreenI检测模式。SYBRGreenI染料方法：是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值。CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Tagman探针：是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。RAPD（随机扩增的多态性DNA）：运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。原理：利用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（通常为10聚体）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性，这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。【DNA提取+选择随机引物—PCR反应—凝胶电泳—图谱分析】。缺点：图谱中某些弱带重复性较差，信息量小，有假阳性结果等等。差别表达基因分析技术：1.mRNA差异显示技术（DD）2.代表性差示分析技术（RDA）3.抑制性差减杂交技术（SSH）----提取目标样和参照样；将目标样与残照样杂交得到产物；合并杂交产物；特异性片段扩增----该方法能使假阳性率降低到6%4.交互差减RNA差别显示技术（RSDD）。分子杂交相关技术：互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子的过程称为杂交。杂交的双方是所使用的探针和要检测的核酸。根据核酸的性质：DNA和RNA探针；根据是否使用放射性标记物：放射性和非放射性标记探针；根据是否存在互补链：单链和双链；根据放射性标记物掺入情况：均匀标记和末端标记。1）双链DNA探针：其合成方法有--切口平移法和随机引物合成法。切口平移法：当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coliDNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3’羟基末端。通常使用--[α-32P]dNTP。随机引物合成法：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow片段，合成含有标记核苷酸的DNA链。具有聚合活性，没有5’至3’外切酶活性,称为Klenow片段。2）末端标记DNA探针：3’末端标记（利用Klenow片段及T4DNA聚合酶）和DNA5’末端标记（利用T4多核苷酸激酶PNK）。AKP碱性磷酸酶—去磷酸化3）单链DNA探针：以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成；以RNA为模板，用反转录酶合成。4）Dig标记的核苷酸分子杂交：分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位置。Southern杂交和Northern杂交。Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。步骤：酶切、DNA片段转移、预杂交、杂交、显色反应。硝酸纤维素滤膜所得的结果背景较低，但易破裂；尼龙膜较耐用，但所得的结果背景较高。硝酸纤维素膜结合DNA依赖高盐溶液。DNA转移方法：毛细管转移、真空转移、电泳转移。Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交，被检对象为RNA，探针为DNA或RNA。影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度、温度、封闭试剂、离子强度。变性，酸处理的目的？基因的原核表达：原核表达系统由原核表达寄主菌及原核表达质粒组成，优点:操作简单、方便、快速、成本低、产量高、纯化容易；缺点：产物多以包涵体形式存在；不含内含子，没有转录及翻译后加工过程，表达产物不能正