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基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程变异实质结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因（DNA）DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达基因重组基因工程的概念转基因抗虫棉抗虫棉普通棉•基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与运载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)•上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？回忆：•基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与运载体DNA连接关键步骤三：抗虫基因导入受体(棉花)细胞•解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？关键步骤一的工具：关键步骤二的工具：关键步骤三的工具：基因的剪刀——限制性内切酶基因的针线——DNA连接酶基因的运载工具——运载体DNA重组技术的基本工具本节知识内容§1DNA重组技术的基本工具专题一基因工程“分子手术刀”──限制酶“分子缝合针”──DNA连接酶“分子运输车”──基因进入受体细胞的载体识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。4000种。1、来源：2、种类：3、作用：4、结果：形成两种末端一、“分子手术刀”——限制性核酸内切酶粘性末端平末端大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶什么叫黏性末端？限制酶•什么叫黏性末端？•什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。碱基序列能够互补特点：什么叫平末端？当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。二、“分子缝合针”——DNA连接酶1、种类：2、作用部位：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶连接两条链缺口上的磷酸二酯键DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。DNA聚合酶DNA复制的时候用什么酶可以连接DNA？回忆DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键相同点：不同点：（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。（3）二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。寻根问底两种末端所用的连接酶是否相同？黏性末端：平末端：区分：E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶T4DNA连接酶外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？导入过程需要运输工具——运载体。P7练习三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体：1.假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？2.作为载体没有切割位点将怎样？3.目的基因是否进入受体细胞，你如何去察觉？4.如果载体对受体细胞有害将怎样？不能分离会怎样？思考：•作为载体必须具备哪些条件？想一想1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些遗传标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。）4）对受体细胞无害、易分离。作为载体必须具备的条件：•常用的载体：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体之外，能够进行自我复制的双链环状DNA分子。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如抗四环素、氨苄青霉素等的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。——质粒：•大肠杆菌的质粒：①说明质粒能复制并能带着插入的目的基因一起复制的是──“复制原点”。②说明质粒有切割位点的是──“目的基因的插入位点”。③说明有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别的是──“氨苄青霉素抗性基因”④说明没有危害──此质粒来自大肠杆菌。其他载体：λ噬菌体的衍生物动植物病毒等常用载体：细菌质粒具备条件：①能自我复制；②有切割位点；③有遗传标记基因④对受体细胞无害、易分离。三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体：•如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。模拟制作绿色纸板粉色纸板剪刀透明胶1、材料用具：——目的基因——载体——EcoRⅠ——DNA连接酶4种碱基序列（目的基因或载体上的碱基序列）胶水（用来贴基因或载体上的碱基序列）重组DNA分子的模拟制作模拟制作（1）在蓝色、橙色纸板上依次贴上有关的碱基序列。（注意：选对碱基序列）2、方法步骤：（2）用剪刀进行DNA“切割”。从两块硬纸板中找出-G-A-A-T-T-序列，找到G-A切口，进行切割。（3）制成重组DNA分子。用透明胶将橙色纸板DNA连接到蓝色纸板上。（注意：碱基准确配对才算成功）模拟制作思考与讨论1、不能。因为一般基因有上千个碱基对。2、可能是剪切位点或连接位点选得不对（也可能是其他原因）。DNA重组技术的基本工具本节知识小结§1DNA重组技术的基本工具专题一基因工程限制酶（“分子手术刀”）DNA连接酶（“分子缝合针”）来源：原核生物作用：识别特定核苷酸序列，结果：形成两种末端切割特定部位的磷酸二酯键基因进入受体细胞的载体（“分子运输车”）具备条件：常用载体：细菌质粒其他载体：λ噬菌体的衍生物动植物病毒等种类：作用：连接磷酸二酯键E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T磷酸二酯键1234512345A