基因工程探索性综合性实验一　龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转

《基因工程》探索性综合性实验一龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(Galactose-1-phosphateuridylyltransferase，GPU）基因拷贝数的确定背景情况介绍Division:RhodophytaClass:RhodophyceaeSub-class:FlorideaeOrder:GigartinalesFamily:GracilariaceaeTGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT该基因已克隆于pMD18T质粒载体上，长度为364bp，现可提供含有该质粒的甘油菌JM109实验过程要求根据题目通过网络和杂志查阅文献，提交实验准备报告，内容包括。题目名称、原理、技术路线、具体实验步骤、需要使用的试剂（溶液）名称及其具体配制方案、其它需要使用的消耗材料（需要器皿清单）注意事项：独立完成实验原理基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切，用GPU基因探针杂交，若有多拷贝，则应有多个杂交带，若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。技术路线总DNA提取酶切GPU基因探针杂交显示SouthernBlot原理探针标记（Random）实验材料和试剂（/组）红藻2.5g；CTAB缓冲液5ml；酚/氯仿/异戊醇抽提液2ml；10T/1E1ml；10T/0.1E1ml；3M醋酸钠溶液1ml变性液20ml；中和液40ml；转移液100ml；洗膜液I10ml；洗膜液II10ml；缓冲液I100ml；缓冲液II20ml；缓冲液III20ml；显色液10ml；缓冲液IV30ml实验步骤1、红藻总DNA的提取称取2.5g藻，加1~2ml/gCTAB缓冲液（勿忘加巯基乙醇），加2gPVPP固体，在冰浴中用力充分研磨（大约半小时）。然后转移于塑料离心管中在60-65℃温浴30min，不时颠倒混合，加蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100g/ml，50℃3h，不时颠倒混合，用等体积酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）（取下层有机相）抽提（颠倒混合）10min，12000rpm离心5min，取上清，用氯仿抽提5min，12000rpm离心5min。取上清液，加入2/3体积的异丙醇，颠倒混合，在-20℃下沉淀15min，再于室温12000rpm离心15min，祛除上清，用1ml70%乙醇洗沉淀，12000rpm离心15min，祛除上清，空气干燥沉淀。37℃下，把核酸溶在100-200lTE1（10mMTris-Hcl，pH8.0，1mMEDTA）10min，14000rpm离心5min。在不干扰沉淀的情况下，把上清液移到新的微量管中，加RNase(10mg/ml)至终浓度100g/ml，37℃消化30min，酚-氯仿抽提后，加1/10体积3M醋酸钠和2倍体积的-20℃无水乙醇，立即离心使DNA沉淀，用70%的-20℃乙醇洗涤沉淀DNA，空气干燥，把DNA溶在50lTE2（10mMTris，pH8.0，0.1mMEDTA）。2、取5l龙须菜总DNA制品加1/10体积载样缓冲液做电泳检测，并加5l分子量对照，目测定量。3、用3~4种（每组选择一种）限制性内切酶酶切5g/种，一般20l酶切体系/1gDNA（见说明书）,等量放大。完全酶切过夜后于80v1.0%琼脂糖凝胶电泳1h，并加5l分子量对照。记录Marker各条带及样品位置，做Southern转迹。4、探针的制备和标记对提取的含目的基因的质粒，按试剂盒说明标记探针及检测标记率，按试剂盒操作说明P13表准备标记探针和对照，管2~9各1l点于膜上，膜自然晾干，80℃烘烤2h，进行显色操作。探针稀释到终浓度10ng/l。5、SouthernBlot：将凝胶放入培养皿中，加入20ml变性液（没过凝胶），摇动变性1h，倾去变性液，用蒸馏水漂洗一次；换中和液20ml，摇动1h，之间更换一次中和液；在电泳槽内加适量转移液20XSSC，中间支架放一滤纸条，滤纸两端浸没在20XSSC中，滤纸与支架间不能有气泡，取出中和的凝胶，点样孔朝下倒扣于滤纸上，用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡，剪一张与胶大小相同的NC膜，放在无菌蒸馏水表面，使之自然吸水下沉，将膜转入20XSSC中浸泡5min，将湿润的膜盖在凝胶上面，膜一经与凝胶接触，不可再移动；将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡，滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸（高8~10cm），吸水纸上压0.5~1kg重物，转移12h。6、转移后，在膜上做标记，紫外检测凝胶转移效果，膜自然晾干，80℃烘烤2h。7、膜的预杂交、杂交和显色。37~42℃预热DigEasyHyb，以1.2ml/12cm2量添加该液，封膜，预杂交30min。探针100℃5min变性后迅速置于0℃，倾去预杂交液，以0.42ml/12cm2膜量加新预杂交液，添加10ng变性标记探针，封膜，42℃杂交过夜或68℃6h水浴震荡。杂交完成后倒出杂交液，将膜放入小烧杯中加5ml洗涤液I，rt洗涤5min，重复一次，倒出洗涤液，加5ml洗涤液II，68℃洗涤15min，重复一次，取出膜于滤纸上，空气干燥。(以下为显色过程)膜于小烧杯中加5ml缓冲液I，洗涤1min，倒去缓冲液I，加10ml缓冲液II，rt放置30min，倒去缓冲液II，家5ml缓冲液I，洗涤30s，取出膜置于培养皿内，以5ml含DigAp结合物的缓冲液I/50cm2膜量（内含DigAp抗体1l）添加，rt30min，取出膜置于小烧杯中，加10ml缓冲液I，洗涤15min，重复一次，倒去缓冲液I，加缓冲液III1.25ml，放置2min，（配制显色液）倾去缓冲液III，加5ml显色液，置于暗中静止待显色，显色结束取出膜加3ml缓冲液IV，洗涤5min，空气干燥。实验注意事项：有毒害物质及其处理（巯基乙醇、EB、苯酚/氯仿）设备（紫外透射仪、离心机）统筹兼顾、提前设计实验周期：4~5天实验报告：实验原理、步骤、结果与讨论、建议。《基因工程》探索性综合性实验二龙须菜、真江蓠、扁江蓠亲缘关系研究分布GracilariaverrucosaIndonesiaGracilariaverrucosaItalyGracilariaverrucosaJapanGracilariaverrucosaKorea,NorthGracilariaverrucosaKorea,SouthGracilariaspp.ItalyGracilariaspp.MalaysiaGracilariaspp.PortugalGracilariaspp.ThailandGracilariaspp.VietnamGracilariatenuistipitatavar.liuiChinaGracilariatenuistipitatavar.liuiPhilippinesGracilariatenuistipitatavar.liuiThailandGracilariatenuistipitatavar.liuiVietnamGracilariaverrucosaArgentinaGracilariaverrucosaEgyptGracilariaverrucosaFranceGracilariaheterocladaPhilippinesGracilariaheterocladaVietnamGracilariahoweiPeruGracilarialemaneiformisJapanGracilarialemaneiformisMexicoGracilarialemaneiformisPeruGracilarialongaItalyGracilariapacificaCanadaGracilariaparvisporaUnitedStatesofAmericaGracilariasalicorniaThailandGracilariasalicorniaVietnamGracilariaspp.BurmaGracilariaasisaticaChinaGracilariaasisaticaVietnamGracilariabursa-pastorisJapanGracilariacaudataBrazilGracilariachangiiThailandGracilariachilensisChileGracilariachilensisNewZealandGracilariacorneaBrazilGracilariacorneaCaribbeanGracilariacoronopiferaUnitedStatesofAmericaGracilariacoronopiferaVietnamGracilariacrassissimaCaribbean根据NCBI数据库登录的红藻基因序列，采用rDNA转录间隔区ITS1和ITS2进行亲源关系的研究。实验原理技术路线设计引物总DNA提取或裂解藻细胞PCR回收目的片段TA克隆转化测序分析实验过程要求同前真核生物rDNA结构单元SSUrDNAandITS*Curdiea/Melanthalia*Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlanticspecies*Gracilaria:^Atlanticcylindricalhenriquesiana/^gracilis/^domingensiscladesITS1:Pacific/Atlantic/cylindricalhenriquesianalineage/gracilislineage/flattedorcompressedAtlanticspecies-lowbootstrapvalueITS2:tikvahiaelineage-compressedtoflattedformswith“textorri”typespermatangiaandsimilarmorphology/cervicornislineage-lowbootstrap/flattedribbon-likespeciesPCR技术原理循环denature94C30SannealingTm-5Celongate72Ccycle25-35实验材料和试剂（/组）红藻2.5g；CTAB缓冲液5ml；LB固体培养基100ml；LB液体培养基50ml；0.75mMCaCl220ml；预先准备冰浴，研钵，60-65℃水浴/50℃水浴实验步骤1、红藻总DNA的提取-同前2、PCR反应及感受态制备准备：合成引物以ddH2O按说明配制成50pmol/l。在25l反应体系中按如下量和条件进行PCR反应：10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP1l,primers0.5leach,25mMMg2+3l,Temp2l,Tag0.1l,以ddH2O补充终体积，液面加25l石蜡油;94C10min,94C1min1min,50C1min30s,72C2min,30circle。现有两对引物pair1（SNria和ASria）和pair2（SNria和AS