基因工程探索性综合性实验一 龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转

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《基因工程》探索性综合性实验一龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶(Galactose-1-phosphateuridylyltransferase,GPU)基因拷贝数的确定背景情况介绍Division:RhodophytaClass:RhodophyceaeSub-class:FlorideaeOrder:GigartinalesFamily:GracilariaceaeTGTAGCCAAAGCTGTGCGTGGAAAATGTCGCGTTGTCTGCTTCTCCCCGAAGCTCAACCTAACTGTCGCTGAAATGGCCGTCAAGGAGATCAAGGCCGTTGTTGATGCCTGGGTTGAGGAGTATGACACCCTCTCCAAGCTCGATTACATCGGCCACGTGCAGATCTTCGAGAACAAGGGACAGATGATGGGATGCTCCAACCCTCATCCTCACGGTCAGATCTGGGCATCTGAGTTCGTTCCAGAAGAGCCGCGCATCGCACTCGCCAATCTCAAAGCCTATCACACTAAGAAGGGAACCCACATGTTGGAGGACTACGTCAAACTCGAAATGGAAGCAAAGGAACGTATCGTATGTCAGAAT该基因已克隆于pMD18T质粒载体上,长度为364bp,现可提供含有该质粒的甘油菌JM109实验过程要求根据题目通过网络和杂志查阅文献,提交实验准备报告,内容包括。题目名称、原理、技术路线、具体实验步骤、需要使用的试剂(溶液)名称及其具体配制方案、其它需要使用的消耗材料(需要器皿清单)注意事项:独立完成实验原理基因组DNA用多种不同的限制性内切酶酶切,用GPU基因探针杂交,若有多拷贝,则应有多个杂交带,若多数酶切结果显示单一条带则为单拷贝。技术路线总DNA提取酶切GPU基因探针杂交显示SouthernBlot原理探针标记(Random)实验材料和试剂(/组)红藻2.5g;CTAB缓冲液5ml;酚/氯仿/异戊醇抽提液2ml;10T/1E1ml;10T/0.1E1ml;3M醋酸钠溶液1ml变性液20ml;中和液40ml;转移液100ml;洗膜液I10ml;洗膜液II10ml;缓冲液I100ml;缓冲液II20ml;缓冲液III20ml;显色液10ml;缓冲液IV30ml实验步骤1、红藻总DNA的提取称取2.5g藻,加1~2ml/gCTAB缓冲液(勿忘加巯基乙醇),加2gPVPP固体,在冰浴中用力充分研磨(大约半小时)。然后转移于塑料离心管中在60-65℃温浴30min,不时颠倒混合,加蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度100g/ml,50℃3h,不时颠倒混合,用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(取下层有机相)抽提(颠倒混合)10min,12000rpm离心5min,取上清,用氯仿抽提5min,12000rpm离心5min。取上清液,加入2/3体积的异丙醇,颠倒混合,在-20℃下沉淀15min,再于室温12000rpm离心15min,祛除上清,用1ml70%乙醇洗沉淀,12000rpm离心15min,祛除上清,空气干燥沉淀。37℃下,把核酸溶在100-200lTE1(10mMTris-Hcl,pH8.0,1mMEDTA)10min,14000rpm离心5min。在不干扰沉淀的情况下,把上清液移到新的微量管中,加RNase(10mg/ml)至终浓度100g/ml,37℃消化30min,酚-氯仿抽提后,加1/10体积3M醋酸钠和2倍体积的-20℃无水乙醇,立即离心使DNA沉淀,用70%的-20℃乙醇洗涤沉淀DNA,空气干燥,把DNA溶在50lTE2(10mMTris,pH8.0,0.1mMEDTA)。2、取5l龙须菜总DNA制品加1/10体积载样缓冲液做电泳检测,并加5l分子量对照,目测定量。3、用3~4种(每组选择一种)限制性内切酶酶切5g/种,一般20l酶切体系/1gDNA(见说明书),等量放大。完全酶切过夜后于80v1.0%琼脂糖凝胶电泳1h,并加5l分子量对照。记录Marker各条带及样品位置,做Southern转迹。4、探针的制备和标记对提取的含目的基因的质粒,按试剂盒说明标记探针及检测标记率,按试剂盒操作说明P13表准备标记探针和对照,管2~9各1l点于膜上,膜自然晾干,80℃烘烤2h,进行显色操作。探针稀释到终浓度10ng/l。5、SouthernBlot:将凝胶放入培养皿中,加入20ml变性液(没过凝胶),摇动变性1h,倾去变性液,用蒸馏水漂洗一次;换中和液20ml,摇动1h,之间更换一次中和液;在电泳槽内加适量转移液20XSSC,中间支架放一滤纸条,滤纸两端浸没在20XSSC中,滤纸与支架间不能有气泡,取出中和的凝胶,点样孔朝下倒扣于滤纸上,用玻璃棒滚动去除胶与滤纸的气泡,剪一张与胶大小相同的NC膜,放在无菌蒸馏水表面,使之自然吸水下沉,将膜转入20XSSC中浸泡5min,将湿润的膜盖在凝胶上面,膜一经与凝胶接触,不可再移动;将两张与膜大小相同的滤纸置2XSSC溶液中湿润,盖在膜上,排除气泡,滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸(高8~10cm),吸水纸上压0.5~1kg重物,转移12h。6、转移后,在膜上做标记,紫外检测凝胶转移效果,膜自然晾干,80℃烘烤2h。7、膜的预杂交、杂交和显色。37~42℃预热DigEasyHyb,以1.2ml/12cm2量添加该液,封膜,预杂交30min。探针100℃5min变性后迅速置于0℃,倾去预杂交液,以0.42ml/12cm2膜量加新预杂交液,添加10ng变性标记探针,封膜,42℃杂交过夜或68℃6h水浴震荡。杂交完成后倒出杂交液,将膜放入小烧杯中加5ml洗涤液I,rt洗涤5min,重复一次,倒出洗涤液,加5ml洗涤液II,68℃洗涤15min,重复一次,取出膜于滤纸上,空气干燥。(以下为显色过程)膜于小烧杯中加5ml缓冲液I,洗涤1min,倒去缓冲液I,加10ml缓冲液II,rt放置30min,倒去缓冲液II,家5ml缓冲液I,洗涤30s,取出膜置于培养皿内,以5ml含DigAp结合物的缓冲液I/50cm2膜量(内含DigAp抗体1l)添加,rt30min,取出膜置于小烧杯中,加10ml缓冲液I,洗涤15min,重复一次,倒去缓冲液I,加缓冲液III1.25ml,放置2min,(配制显色液)倾去缓冲液III,加5ml显色液,置于暗中静止待显色,显色结束取出膜加3ml缓冲液IV,洗涤5min,空气干燥。实验注意事项:有毒害物质及其处理(巯基乙醇、EB、苯酚/氯仿)设备(紫外透射仪、离心机)统筹兼顾、提前设计实验周期:4~5天实验报告:实验原理、步骤、结果与讨论、建议。《基因工程》探索性综合性实验二龙须菜、真江蓠、扁江蓠亲缘关系研究分布GracilariaverrucosaIndonesiaGracilariaverrucosaItalyGracilariaverrucosaJapanGracilariaverrucosaKorea,NorthGracilariaverrucosaKorea,SouthGracilariaspp.ItalyGracilariaspp.MalaysiaGracilariaspp.PortugalGracilariaspp.ThailandGracilariaspp.VietnamGracilariatenuistipitatavar.liuiChinaGracilariatenuistipitatavar.liuiPhilippinesGracilariatenuistipitatavar.liuiThailandGracilariatenuistipitatavar.liuiVietnamGracilariaverrucosaArgentinaGracilariaverrucosaEgyptGracilariaverrucosaFranceGracilariaheterocladaPhilippinesGracilariaheterocladaVietnamGracilariahoweiPeruGracilarialemaneiformisJapanGracilarialemaneiformisMexicoGracilarialemaneiformisPeruGracilarialongaItalyGracilariapacificaCanadaGracilariaparvisporaUnitedStatesofAmericaGracilariasalicorniaThailandGracilariasalicorniaVietnamGracilariaspp.BurmaGracilariaasisaticaChinaGracilariaasisaticaVietnamGracilariabursa-pastorisJapanGracilariacaudataBrazilGracilariachangiiThailandGracilariachilensisChileGracilariachilensisNewZealandGracilariacorneaBrazilGracilariacorneaCaribbeanGracilariacoronopiferaUnitedStatesofAmericaGracilariacoronopiferaVietnamGracilariacrassissimaCaribbean根据NCBI数据库登录的红藻基因序列,采用rDNA转录间隔区ITS1和ITS2进行亲源关系的研究。实验原理技术路线设计引物总DNA提取或裂解藻细胞PCR回收目的片段TA克隆转化测序分析实验过程要求同前真核生物rDNA结构单元SSUrDNAandITS*Curdiea/Melanthalia*Gracilariopsis/Gracilariophila:^Atlanticspecies*Gracilaria:^Atlanticcylindricalhenriquesiana/^gracilis/^domingensiscladesITS1:Pacific/Atlantic/cylindricalhenriquesianalineage/gracilislineage/flattedorcompressedAtlanticspecies-lowbootstrapvalueITS2:tikvahiaelineage-compressedtoflattedformswith“textorri”typespermatangiaandsimilarmorphology/cervicornislineage-lowbootstrap/flattedribbon-likespeciesPCR技术原理循环denature94C30SannealingTm-5Celongate72Ccycle25-35实验材料和试剂(/组)红藻2.5g;CTAB缓冲液5ml;LB固体培养基100ml;LB液体培养基50ml;0.75mMCaCl220ml;预先准备冰浴,研钵,60-65℃水浴/50℃水浴实验步骤1、红藻总DNA的提取-同前2、PCR反应及感受态制备准备:合成引物以ddH2O按说明配制成50pmol/l。在25l反应体系中按如下量和条件进行PCR反应:10XPCRBuffer2.5l,10mMdNTP1l,primers0.5leach,25mMMg2+3l,Temp2l,Tag0.1l,以ddH2O补充终体积,液面加25l石蜡油;94C10min,94C1min1min,50C1min30s,72C2min,30circle。现有两对引物pair1(SNria和ASria)和pair2(SNria和AS

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