基因工程概论

19基因工程概论　　基因工程（geneengineering）是狭义的遗传工程（geneticengineering），指按照人们预先设计好的蓝图，从分子水平上对基因进行体外操作，将外源基因加工后插入到质粒和病毒等载体中，转化受体细胞并使目的基因得以扩增和表达，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需的生物性状或基因工程产品的技术。基因工程的核心技术是DNA重组技术，另外还包括基因的定位、分离、克隆、定点突变、测序技术、转化技术、基因表达的分子检测技术、产物的分离、纯化技术，以及基因打靶和基因治疗技术等。各种工具酶的发现，载体的扩展和DNA扩增与测序技术的进展也为基因工程创建奠定了技术基础。可见基因工程是遗传学和分子生物学发展的必然产物，它又是将这些基本理论转变为巨大生产力的体现。自1972年基因工程创建以来，在这短短的30余年间已发生了巨大而深刻的变化，基因工程产品已成为许多国家的支柱产业，在国民经济建设中具有重大意义。456　　19畅1　基因工程的基本原理19畅1畅1　基因工程的主要程序　　基因工程一般包括以下主要程序（图191）：①目的基因的制备：从复杂的生物体基因组中，经酶切消化和PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。或通过筛选文库、PCR、图位克隆等方法克隆目的基因。②重组DNA分子的构建：在体外将带有目的基因的外源DNA片段连接到具有自我复制能力和选择标记的载体中，构建重组DNA分子。③重组DNA分子转移到受体细胞：将人工构建的重组DNA分子通过转化、感染或注射等手段转移到适当的受体细胞，并使之整合和稳定增殖。④转化子的筛选：从大量繁殖细胞群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆，提取已得到扩增的目的基因以供进一步研究。⑤目的基因表达与功能的鉴定：将目的基因克隆到表达载体中，导入受体细胞或转至动植物体中以检测目的基因表达产物的性质和转基因动植物的遗传特性（图191）。图191　基因工程的基本程序19　基因工程概论457　　19畅1畅2　基因工程常用的实验技术（1）核酸电泳技术　　DNA和RNA的常规电泳一般以琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶为介质，测序反应一般则用毛细管电泳。琼脂糖电泳分离DNA分子，一般与其相对分子质量大小和构型有关，由于分子筛效应,各种不同大小的线状DNA分子在电泳时受到的阻力与琼脂糖的浓度不同，因而得以分离。毛细管电泳具有更高的速度和分辨率。（2）核酸杂交技术　　核酸杂交技术是基于DNA或RNA依据碱基配对的规律，形成双链的过程，符合核酸的复性动力学。将DNA或RNA吸附到固体薄膜上，与标记好的探针在一定条件下杂交，经洗脱就可以显示与探针互补的核酸杂交带。经电泳分离的DNA印迹到硝酸纤维素或尼龙膜上的过程为Southernblot，RNA的印迹为Northernblot。（3）转化技术　　体外构建的重组DNA必须转入宿主细胞（受体细胞），才能实现目的基因的扩增和表达。有多种方法将重组DNA转入宿主细胞，但细菌的转化是最基本、最有效的方法之一，为了研究的需要，有时我们还需将重组DNA转入酵母菌、昆虫细胞或动植物细胞中。（4）DNA的酶切和连接技术　　DNA的酶切和连接是最基本的基因操作技术。要保证DNA被充分酶切，提取的DNA质量要高，含杂质较少；DNA有时不能被酶切，或者非特异性酶切，这与DNA结合的蛋白质及其他无机盐和变性剂的存在有关，这些因素直接影响限制性内切酶的活性。DNA的连接反应是由T4DNA连接酶催化的，以ATP为能量，将双链DNA的黏性末端及平端相邻的3′羟基与5′磷酸共价连接。黏性末端的连接效率一般很高，而平端的连接效率则很低，但加入PEG等物质可提高其连接效率，为了避免在连接反应中载体自连形成空载体，一般可采用双酶切定向插入技术或将载体末端脱磷，使其不能发生自连，而由插入片段和脱磷载体连接而成的有缺口的环状分子同样有较高的转化效率。（5）DNA测序技术　　目前许多测序公司采用的是四色荧光标记的双脱氧核苷酸末端终止法，配合阵列毛细管可以实现高通量、长片段的DNA测序。各种不同长度的DNA片段经毛细管电泳分离，激光激发就可以判断碱基的种类及其位置。2006年已实现测序技术的又一次突破，其速度是目前最先进的测序仪的100倍。该技术的原理是每合成一个核苷酸，就会释放一个焦磷酸，而贮存在焦磷酸中的能量被焦磷酸酶水解时可导致荧光物质的激发，从而可检测到互补碱基的合成。这种焦磷酸测序法由于结合了大规模的微株克隆和分选技术，测序的总速度很快。（6）DNA合成技术　　目前多采用固相亚磷酸三酯法合成DNA。该技术合成的DNA多在60bp左右，而且要求通过聚丙烯酰胺凝胶纯化回收产物才能保证其正确性。DNA的化学合成能力上限为150～200bp，这可完全满足PCR引物的需求，但对于绝大多数基因的人工合成则必须采用分段合成、互补组装的方法，许多小基因及启动子可完全按照人们所需的序列进行人工全合成。不过，所合成的基因必须经过测序反应验证无误后才可进行基因工程的下一步操作。（7）PCR技术　　聚合酶链反应（PCR）是基因工程中最常用的实验技术之一。从理论上讲，任何DNA经适当引物的引导，循环30多次后，靶序列就可扩增上百万倍。其原理就是体外多次模拟DNA复制的过程，每一轮循环后经94℃变性，双链DNA分离，低温复性后，引物与模板结合，在72℃延伸时则发生DNA的指数合成。PCR反应灵敏度很高，可对单个细胞样品中的DNA进行扩增，获得目的DNA片段。各种不同类型的PCR反应已得到广泛应用，如反向PCR（reversePCR），锚定PCR，RTPCR19畅1　基因工程的基本原理458　　（reversetranscriptionPCR），不对称PCR（asymmetricPCR），重组PCR等。　　以上这些技术的详细操作过程，可参阅有关分子生物学实验技术手册。19畅2　基因工程工具酶19畅2畅1　限制性内切酶　　限制性内切酶可识别DNA分子内部的特定序列并在固定的部位将其切断，属于限制修饰系统的成员之一。限制性内切酶根据它们的特性而分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等，目前广泛使用的属于第Ⅱ类限制性内切酶。由于Ⅰ型和Ⅲ型限制性内切酶识别的位点与切割位点分离，并且酶成分复杂，具有多种功能，且种类稀少，在基因工程中很少应用。Ⅱ型限制性内切酶具有以下基本特性：①识别位点序列和切割序列一致，且该序列多具有回文结构。②所切割的位点常呈轴对称分布，即产生黏性末端（图192）。也有部分限制性内切酶产生平端。③所产生的互补黏性末端长度多为4～8bp，它们可以配对并被DNA连接酶高效连接（图192）。图192　几种限制酶的识别序列和切割位点　　限制性内切酶识别序列的长短决定了其在基因组中出现的频率，4核苷酸出现的频率在理论上19　基因工程概论459　　为1／256，而6核苷酸则为1／4096，8核苷酸为1／65536。这些识别8个以上核苷酸的限制性内切酶由于在基因组中出现的频率较低，常用于构建大尺度的物理图谱及BAC、YAC文库。不同的限制性内切酶的酶切所产生的黏性末端可不同，有3′端突出的（例如PstⅠ），也有5′端突出的（例如EcoRⅠ）。不同的限制性内切酶对所识别和切割的序列核苷酸中碱基的甲基化敏感程度不同，有的非常敏感，有的则不敏感。有时会发现同一序列可被不同的限制性内切酶识别，其切割的位点不同。由不同的限制性内切酶识别切割相同位点的序列产生相同的末端，这些酶为同工酶或同裂酶（isoschi唱zomers）。而由不同限制性内切酶识别切割不同的位点，但产生的末端相同，这些酶则为同尾酶（iso唱caudamer）。19畅2畅2　连接酶　　T4DNA连接酶（DNAligase）对5′端具有磷酸、3′端为OH的双链黏性末端或平末端DNA均具有连接作用，但效率不同，对单链DNA不具连接活性。T4DNA连接酶以ATP为能源，而大肠杆菌DNA连接酶则以NAD＋为能源。在体内DNA连接酶主要是封闭DNA双螺旋上的单链缺口，在DNA断裂与重接及修复过程中发挥重要作用。平端由于连接效率较差，往往采用同聚物加尾或加特定接头加以解决。从嗜热高温放线菌中分离的高温DNA连接酶对高温具有极高的耐受性和稳定性，并在85℃具有连接酶活性。利用该性质可以对特定靶序列进行寡核苷酸的连接反应（oligonu唱cleotideligationassay，OLA）及连接酶链反应（ligasechainreaction，LCR）。19畅2畅3　DNA聚合酶　　根据模板的不同可将DNA聚合酶（DNApolymerase）分为两类，依赖DNA的DNA聚合酶和依赖于RNA的DNA聚合酶。前者包括大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶。后者又被称为逆（反）转录酶。它们的共同特征都是按照模板的核苷酸序列，将dNTP依次加到DNA分子的3′—OH上，催化其聚合反应，形成DNA长链分子。但不同DNA聚合酶的聚合能力及外切活性明显不同。　　逆转录酶（reversetranscriptase，RT）是以RNA为模板，在引物及dNTP的存在下合成DNA的一种酶。逆转录酶通常用于将mRNA逆转录为cDNA，可以oligo（dT）或随机引物引导合成DNA，对构建cDNA文库和RTPCR十分重要，但该酶因不具备3′—5′外切校正功能，因而在合成DNA的过程中可能有较高的突变率，另外该酶持续合成DNA的速度较低，多数不耐高温，对于较长mRNA的逆转录可能因为二级结构的空间阻碍而中途停止。但目前已有能耐60℃高温的逆转录酶商品，可有效提高其转录效率。19畅2畅4　修饰酶（1）末端转移酶　　从小牛胸腺中分离的末端转移酶（terminaltransferase）有两种亚基，该酶在无模板的情况下，就可催化dNTP在DNA片段3′—OH端的聚合反应，3′—OH单链DNA及3′突出的双链DNA都是其有效底物，但平端效果较差，不过，在Ca2＋代替Mg2＋时也可发生末端聚合反应。该酶主要应用于DNA片段的同聚物加尾克隆和末端标记反应。（2）T4多核苷酸激酶　　从T4噬菌体中分离的多核苷酸激酶（polynucleotidekinase，PNK）可催化ATP的γ磷酸转移到DNA或RNA分子5′—OH末端，使其磷酸化。该酶主要应用于DNA5′端标记反应，以及PCR产物进行的连接反应中。（3）碱性磷酸酶　　细菌的碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）和小牛肠道碱性磷酸酶（calfintestineal唱19畅2　基因工程工具酶460　　kalinephosphatase，CIP）均可催化核酸分子脱除5′磷酸，该酶广泛应用于载体脱磷，避免载体自连反应。BAP耐热，而CIP不耐热，但其活性比BAP要高10～20倍，因此在基因工程中CIP应用较为普遍。（4）外切核酸酶　　外切核酸酶（exonuclease）可以从核酸的一端开始催化逐个降解核苷酸，按其特性及底物性质可分为单链外切核酸酶和双链外切核酸酶，前者包括大肠杆菌外切酶Ⅰ、外切酶Ⅶ，后者包括大肠杆菌外切酶Ⅲ、λ外切酶，T7基因σ外切酶等。（5）Bal31外切核酸酶　　Bal31外切核酸酶（Bal31exonuclease）既有单链特异性内切降解活性，又有双链特异性的外切降解活性。该酶的活性需Ca2＋和Mg2＋参与。可将含缺口的环状DNA切断，并从其两端降解。主要应用于基因的缺失突变、限制性位点分布及DNA二级结构的测定。19畅3　基因工程中的载体19畅3畅1　克隆载体（1）质粒　　①pBR322质粒　该质粒长4361bp，含有氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、ColE1派生质粒pMb1的复制起点，常用的限制性内切酶单切点有PstⅠ（位于ampr中）、BamHⅠ、SalⅠ（位于tetr中）、EcoRⅠ（位于ampr启动子中）、HindⅢ（位于tetr启动子中）。外源目的基因可插入这两个抗生素基因之一，从而造成插入失活（insertionalinactivation），可通过负选择法获得重组子，该