基因工程涉及的主要技术

基因工程涉及的主要技术遗传专业姓名：张红学号1310170039导师：张斌基因工程基因工程（Geneticengineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的操作流程①DNA和RNA的提取和纯化②PCR扩增③构建基因文库，从基因文库中“钓”取1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定限制酶的切割与连接农杆菌转化法等分子杂交及DNA测序基因工程主要技术DNA和RNA的提取和纯化凝胶电泳基因扩增技术-PCR反应分子杂交DNA序列测序12345一、DNA和RNA的提取和纯化•核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。•一般程序1、供体的核酸分离供体细胞培养收集(菌体)细胞细胞破碎分离总DNA分离细胞器分离总RNA分离细胞器DNARNApoly(A)RNA特异性RNA染色体DNA(组建基因组文库)cDNA（组建cDNA文库）DNA提取的几种方法（1）基因组DNA的提取CTAB法SDS法其它（2）非基因组DNA的提取质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法基因组DNA-CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液质粒DNA－碱裂解法碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤总RNA的提取根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种制备方法：1）热苯酚抽提法2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍3）LiCl/尿素法其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。二、凝胶电泳常见的凝胶电泳电泳主要类型分离根据适用范围琼脂糖凝胶电泳电荷量、相对分子质量和构型核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳相对分子质量、电荷核酸和蛋白质脉冲电场凝胶电泳在交流电场中做出反应的时间分离长至5Mb的DNA分子等电点聚焦电泳等电点蛋白质琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳的原理：分离原理-在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。检测原理-溴化乙锭（EB）在紫外光照射下能发射荧光，当用EB对DNA样品染色时，加入的EB就插入DNA分子中，荧光强度与DNA含量成正比。琼脂糖凝胶电泳分辨大小在0.1-60kb间的DNA片段；而要分辨较小分子质量的DNA片段，要用聚丙烯酰胺凝胶，它的分辨率在0.001-1kb之间。聚丙酰胺凝胶电泳三、基因扩增技术---PCR反应1.PCR的发明（1）（2）Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。1985年Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。2.PCR的发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化1986年H.A.Erilish从嗜热水生菌分离出耐高温的TaqDNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37oC)，PCR技术才进入实用阶段。1988年R.K.Saiki把TaqDNA聚合酶用到PCR反应中。使PCR自动循环仪成为可能。1988年Cetus公司发明自动热循环仪。3.基本原理模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTATGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’3’3’5’5’3’TAGAACTTGACGTACGTA95oC（1）DNA模板变性模板模板（template）95oCTGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。（2）DNA模板与引物复性模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物引物（primer）:40-65oCDNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。（3）DNA链的延伸TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72oC理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。变性—复性—延伸。（4）1个循环的结果（5）新一轮循环开始总体积50-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物（0.1-0.5mol/L）DNA分子模板（50-100ng）Taq酶DNA聚合酶（0.5-2.5U/50L）4.反应体系：5.PCR的应用理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！（1）扩增某一段DNA从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列；在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。（2）基因的体外诱变技术关键：利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。五、分子杂交概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。可用于从基因文库中钓取目的基因等。目前常使用的主要有Sourthern杂交、Northern杂交、Western杂交和原位杂交等。核酸分子杂交核酸分子杂交技术（DNA/DNAorDNA/RNA），是在1968年由华盛顿卡内基学院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。DNA-DNA杂交双链分子同源或部分同源探针总cDNA探针特异性cDNA探针人工合成的寡核甘酸探针探针标记放射性标记32P，3H，35S，14C，125I等非放射性标记地高辛，生物素，荧光素等用于标记dUTP（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern凝胶转移杂交技术如图:基因组DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northernblotting）但它不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。原位杂交：是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。如菌落和噬菌斑印迹法(colonyandplaqueblotting)；五、DNA测序技术一、Sanger双脱氧链终止法二、Maxam-Gilbert化学分析法双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。FrederickSanger,1980年NobelPrize化学奖一、Sanger双脱氧链终止法DNA测序的自动化用四甲基若丹明（tetramethylrhodamine）作荧光剂，预先标记M13引物DNA5’-末端，按标准的双脱氧链终止法同引物进行反应，用聚丙烯酰胺电泳分析。在电泳过程中，用激光激发电泳的片断产生荧光，被荧光感受器接受，最终转换成电信号，被计算机读出，或打印出来二、Maxam-Gilbert化学分析法1977年，哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明。用化学试剂处理末端放射性标记的DNA片断，造成碱基的特异性切割。由此产生的一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按大小分离和放射自显影之后，便可根据x光底片上所显示的相应谱带，直接读出待测DNA片断的核苷酸序列。WalterGilbert,1980年NobelPrize化学奖常规的基因工程技术的研究方法：除了凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA测序技术，还涉及细胞转化、文库构建、酵母双杂交技术等。噢噢噢！与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。引物（primer)①位置3’3’即2.751011bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。引物的长度理论计算：419=2.751011。一般引物设计为长15—30bp。引物的碱基序列5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。templateprimer3）避免形成引物二聚体（dimer）两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAGTCACT5’primer1primer2尽可能提高G+C