基因工程的基本操作工具

☆选修3现代生物科技专题我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，棉花种植面积约占世界的15％。据统计，1992年至1996年，因防治棉铃虫等虫害造成农药中毒的有24万余人。其中仅1992年棉农中毒人数就高达7万多人，直接经济损失达100多亿元。于是我国的棉农一气之下改种了抗虫棉。能杀死棉铃虫的基因来自一种叫做“苏云金芽孢杆菌”的细菌。这种细菌产生的蛋白质叫做晶体蛋白，蛋白本身没有毒性，但由于棉铃虫的胃呈碱性，一旦棉铃虫吃了它，就会在胃中分成两个蛋白，其中一个与胃肠膜特定结合在一起形成穿孔，把棉铃虫毒死。而人和动物的胃则呈酸性，吃后分解成氨基酸，变成了营养物质。一、基因工程诞生的理论基础1．基因拼接(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。碱基互补配对原则2．外源基因在受体内表达(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。(3)生物界共用一套遗传密码。分子手术刀------限制性核酸内切酶(限制酶)A.来源:主要从原核生物中分离纯化B.作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开.二、基因工程的操作工具D.切割后产生的DNA片段末端的形式C.识别序列的组成:大多数由六个核苷酸组成限制酶所识别的序列有什么特点限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。分组讨论：限制酶切割后有两种不同的结果，一种产生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的连接时，也有两种酶。黏性末端平末端2．DNA连接酶(1)常用的DNA连接酶①E·coliDNA连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端②T4DNA连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端(2)DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶作用实质都是催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键是否需模板不需要需要连接DNA链双链单链DNA连接酶DNA聚合酶作用过程在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键作用结果将存在的DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子3.基因进入受体细胞的载体载体必须具备的条件如果载体对受体细胞有害将怎样？目的基因是否进入受体细胞，没有标记基因我们能否鉴定？假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？作为载体没有切割位点将怎样？作为载体的必要条件1、能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；2、具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；3、具有某些标记基因，便于进行筛选。（如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等）4、对受体细胞无害三、基因工程操作的基本程序1．目的基因的获取途径(1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。(2)人工合成目的基因常用的方法有：①已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。②以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。(3)PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等PCR技术DNA复制不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子2.基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子以及标记基因等。(2)基因表达载体的构建方法导入的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。3．将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定(1)分子水平检测①导入检测：DNA分子杂交技术，即使用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段作探针检测。(2)个体生物学水平鉴定：对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验。②表达检测转录检测：分子杂交法，即目的基因作探针与mRNA杂交翻译检测：抗原—抗体杂交法(2010年北京海淀区抽查)下图是含某目的基因的DNA片段，据图回答下列问题。(1)根据图示可知，若用EcoRⅠ和SmaⅠ限制酶切割，则此DNA片段可有_____个限制酶切割位点，切割后共有____种____个切割末端。(2)EcoRⅠ限制酶切割后形成的末端是末端，在图中用笔标出切割部位。(3)如果要将用EcoRⅠ限制酶切割形成的目的基因片段导入受体细胞，一般需要_____作载体。其应具备的特点有：_____、___、___。(4)E·coliDNA连接酶连接目的基因和载体时连接的是图中____(填字母)部位的化学键。【答案】(1)326(不计算原有的)(2)黏性(3)质粒至少有一个切割位点能自我复制含标记基因(4)X(2009年江苏高考题)苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。(1)将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有________种DNA片段。(2)图中②表示HindⅢ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得________种重组质粒；如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得________种重组质粒。(3)目的基因插入质粒后，不能影响质粒的________。(4)图中③的Ti质粒调控合成的vir蛋白，可以协助带有目的基因的T－DNA导入植物细胞，并防止植物细胞中___对T－DNA的降解。(5)已知转基因植物中毒素蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡。而该毒素蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞________。(6)生产上常将上述转基因作物与非转基因作物混合播种，其目的是降低害虫种群中的____基因频率的增长速率。【解析】本题重点考查转基因技术的相关知识，需特别注意基因工程的步骤、DNA的复制、基因工程的操作工具等知识。本题需特别注意图示过程，从中获取有效信息，然后结合课本知识即可正确解答。【答案】(1)4(2)21(3)复制(4)DNA水解酶(5)表面无相应的特异性受体(6)抗性1．(2009年浙江高考题)下列关于基因工程的叙述，错误的是()A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达【解析】基因工程中目的基因来源于自然界中的含有目的性状的一切生物，可以是动物、植物，也可以是真菌、细菌，还可以是人等；在基因工程中获取目的基因以及将目的基因和载体结合构成基因表达载体必须使用同一种限制酶进行切割，以获得相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体连接，构成基因表达载体；人的胰岛素原基因可以在大肠杆菌体内得以表达，但是由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器的加工，合成的胰岛素原不具有胰岛素的功能，即没有生物活性；作为标记基因，有利于重组基因在细胞内表达的鉴定筛选，但对于目的基因的表达没有促进等调控作用。【答案】D2．(2007年高考北京卷)利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白【解析】该题考查了目的基因的检测和目的基因的表达两个概念之间的区别。基因表达的产物是蛋白质，因此，只有在受体细胞中检测或提取到了相应蛋白质才能证明目的基因在受体细胞中完成了表达，A、C只能说明完成了目的基因的导入，B只能说明完成了目的基因的导入和目的基因的转录过程。【答案】D3．(2009年上海高考题)人体细胞内含有抑制癌症发生的P53基因，生物技术可对此类基因的变化进行检测。(1)目的基因的获取方法通常包括___和____。(2)上图表示从正常人和患者体内获取的P53基因的部分区域。与正常人正比，患者在该区域的碱基会发生改变，在上图中用方框圈出发生改变的碱基对；这种变异被称为_____。(3)已知限制酶E识别序列为CCGG，若用限制酶E分别完全切割正常人和患者的P53基因部分区域(见上图)，那么正常人的会被切成个片段；而患者的则被切割成长度为____对碱基和____对碱基的两种片段。(4)如果某人的P53基因部分区域经限制酶E完全切割后，共出现170、220、290和460碱基对的四种片段，那么该人的基因型是____(以P+表示正常基因，P-表示异常基因)。【解析】(1)目的基因既可以从供体细胞中直接提取，也可人工合成。(2)基因内部个别碱基对的替换为基因突变。(3)据图分析可知，正常人会被切成三个片段。(4)由正常人被限制酶E切出来的具体片段可知，该人的基因型是P+P-。【答案】(1)从细胞中分离通过化学方法人工合成(2)见下图基因碱基对的替换(基因突变)(3)3460220(4)P+P-4．(2008年山东高考题)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。(1)获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的____处，DNA连接酶作用于___处。(填“a或“b”)(2)将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和_____法。(3)由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用_____技术，该技术的核心是_____和_____。(4)为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的_____作探针进行分子杂交检测，又要用_____方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。【解析】限制性内切酶的切点选择很严格，只会切断某段特定DNA序列中的某个特定位点——磷酸二酯键，而DNA连接酶可以将该键连接起来。重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法除了农杆菌转化法外，还有基因枪法和花粉管通道法。导入外源基因的细胞需要利用植物组织培养技术将其培养为植株，过程为：取材、去分化(或脱分化)形成愈伤组织、再分化形成试管苗、移栽培育成完整植物体。转基因是否成功，可测定是否有转基因产物产生，也可通过改变条件观察植物性状的变化来加以确定。【答案】(1)aa(2)基因枪(花粉管通道)(3)植物组织培养脱分化(去分化)再分化(4)耐盐基因(目的基因)一定浓度盐水浇灌的(移栽到盐碱地中)5．(2008年江苏高考)将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。图1转基因操作流程图图2引物对与模板结合示意图表1引物对序列表引物对AP1AACTGAAATGTAGCTATCP2TTAAGTCCATTACTCTAG引物对BS1GTCCGACTAGTGGCTGTGS2AGCTGGCGTTTAGCCTCG表2几种限制酶识别序列及切割位点表限制酶AluⅠEcoRⅠPstⅠSmaⅠ切割位点AG↓CTG↓AATTCCTGCA↓GCCC↓GGGTC↑GACTTAA↑GG↑ACGTCGGG↑CCC请根据以上图表回答下列问题。(1)在采用常规PCR方法扩