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1.2基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因也有一些具有调控作用的因子2、获取目的基因的方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成________________________________________①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：___________、_______________、___________、___________、__________②原理：__________聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制模板DNA四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶（二）利用PCR扩增目的基因④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：_______________________________________________________指数2n使目的基因的片段在短时间内大量扩增⑥过程a、变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、复性（复性55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链⑦前提__________________________________________________有一段已知目的基因的核苷酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（DNA合成仪）（三）人工合成若基因_____，核苷酸序列______，可用此法。较小已知（化学合成法）mRNAcDNA单链cDNA分子逆转录酶DNA聚合酶（三）人工合成（反转录法）与直接提取的DNA相比cDNA不含有_____和_____等结构。•真核生物mRNA的形成编码区非编码区RNA聚合酶结合位点非编码区转录加工（剪切、拼接）成熟mRNA只对应外显子部分初级转录物a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用1、基因表达载体的构建目的二、表达载体的构建2、基因表达载体的组成：目的基因标记基因启动子终止子①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生_________________。3、基因表达载体的构建③将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同(插入式)三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——Ca+处理法1、将目的基因导入植物细胞的方法：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：①农杆菌特点：（1）农杆菌转化法Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③过程：1、将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上2、将重组Ti质粒导入农杆菌3、用农杆菌感染植物体细胞（2）基因枪法适用于单子叶植物（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：取卵显微注射受精卵早期胚胎培养胚胎移植3、将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子感受态细胞四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因四、目的基因的检测与鉴定大肠杆菌四、目的基因的检测与鉴定抗原－抗体杂交法分子杂交法DNA分子杂交法目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否导入方法检测对象结果个体水平的鉴定是否显示出杂交带四、目的基因的检测与鉴定个体水平的鉴定（受体是否表现出相应性状）1、鉴定转基因抗虫棉是否具有抗虫性可采用___________实验2、如何鉴定转基因抗盐烟草是否成功？接虫在转基因抗盐烟草田中浇灌盐水，观察其是否有抗盐特性3、用乳腺生物反应器生产人血清白蛋白，如何确定转基因羊培养成功？检测羊乳中是否含有人的血清白蛋白一、乳腺生物反应器1.目的基因是什么？药用蛋白基因2.目的基因前需加的什么启动子？乳腺蛋白基因的启动子3.受体细胞是什么？受精卵4.分泌蛋白质的细胞是？乳腺分泌细胞5.将目的基因导入受体细胞的方法？显微注射法练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：1）将人的生长激素基因导入小鼠受体细胞，常用方法是___________。显微注射2）进行基因转移是，通常要将外源基因转到________中，原因是：受精卵①具有发育的全能性；②体积大，易操作。3）在研制膀胱生物反应器时，应使外源基因在小鼠的_________细胞中特异表达。膀胱上皮练习：继哺乳动物乳腺发生器研发成功后，膀胱生物发生器的研究也取得了一定进展。最近，科学家培养出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。请回答：4）通常采用_____________技术检测外源基因是否插入了小鼠的基因组DNA分子杂交6）与乳腺生物反应器相比，膀胱反应器有什么优点？①不受性别的限制；②没有是否处于生殖期的限制。5）检测人的生长激素是否成功表达可采用___________技术抗原--抗体杂交1、基因治疗概念：二、基因治疗曙光初照将健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，从而达到治疗疾病的目的。（增补策略）2、基因治疗的类型体外基因治疗体内基因治疗3、基因治疗的发展现状：处于初期的临床试验阶段三、蛋白质工程的崛起蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。前提：了解蛋白质的结构和功能途径：目的：改造基因（基因修饰或基因合成）定向改造或制造蛋白质获得自然界没有的蛋白质1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。（1）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，要获得VP1基因可用_____________的方法合成DNA，再用_____________将VP1基因片段切下。反转录法限制酶1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防。疫苗的主要成分是该病毒的一种结构蛋白VP1。科学家尝试利用转基因番茄来生产口蹄疫疫苗，过程如下图所示。请据图回答。（2）过程⑥的培养基中除了加入各种必需营养物质和____________等激素外，还需要添加____________筛选出含有重组质粒的叶片小段。2、某研究小组进行了甲型H1N1流感病毒的疫苗研制工作，下图为他们前期研究工作的简要操作流程图：（1）实验步骤①所代表的反应过程是____________；在步骤②之前扩增H基因常采用的方法是____________。逆转录PCR技术（2）步骤②构建重组表达载体A和重组表达载体B必须使用的酶________________________。限制酶、DNA连接酶（3）构建重组表达载体时，一般需要将H基因与载体结合，常用做基因工程载体的是__________；在检测受体细胞中是否已经导入目的基因时，常常要借助载体上____________的表达。质粒标记基因3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。图6是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答：（1）在基因工程中，抗盐基因被称为_____________，它可用PCR技术扩增，该技术需用_____________酶。目的基因热稳定DNA聚合（2）用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是_____________。图中①、②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用限制酶___________对外源DNA、质粒进行切割。3、科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。图6是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答：（3）为筛选出已导入重组质粒的农杆菌，应在培养基中加_____________。M抗生素（4）为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，在个体水平上鉴定之前，常用__________________________作探针进行分子杂交测试。放射性同位素标记的抗盐基因4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值。右图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：(1)获取目的基因的主要途径包括从自然界已有的物种中分离和________。(2)①过程需要的酶有__________、__________。(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和________，这样才能构成一个完整的基因表达载体。人工合成限制酶DNA连接酶标记基因4、在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较好的应用价值。右图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：(4)如果受体细胞C1是土壤农杆菌，则将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的________，使目的基因进入受体细胞C2，并将其插入到受体细胞C2中____________上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。经②过程获得的转基因莴苣中的目的基因是否表达，在分子水平上可用___________法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因莴苣培育成功。转化作用染色体DNA抗原-抗体杂交根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。（2）质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是________________。（3）按其来源不同，基因工程找那个所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。粘性末端平末端切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同；大肠杆菌T4（4）反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。（5）基因工程中除质粒外，________和__________也可作为运载体（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是________________________。mRNAcDNAPCR噬菌体动植物病毒是未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱