搜索
基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1.从基因文库中获取目的基因1)基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2)基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库基因组文库与部分基因文库的关系3)基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性4)从基因文库中得到目的基因的方法1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC2、利用PCR技术扩增目的基因PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。以方式扩增，即（n为扩增循环的次数）指数2n方式使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增结果原理：DNA双链复制PCR技术•前提：•条件PCR扩增仪一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋边复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶等反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成3.人工合成—化学合成法基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成变式迁移1．(多选)下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是()A．CTTAAGB．GAATTCC．切点在G和A之间D．切点在C和T之间P42．你能否用DNA连接酶将下列末端连接起来？(1)…CTGCA(2)…AC(3)GC……G…TGCG…(4)…G(5)G…(6)…GC…CTTAAACGTC……CG(7)GT…(8)AATTC…CA…G…变式迁移答案：(2)和(7)能连接形成…ACGT……TGCA…(4)和(8)能连接形成…GAATTC……CTTAAG…(3)和(6)能连接形成…GCGC……CGCG…(1)和(5)能连接形成…CTGCAG……GACGTC…3、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温A．①③④⑦⑨B．①④⑥⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑨D．①③⑥⑦⑧D4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个B1000个脱氧核苷酸对，即2000个核苷酸。由于A=T=460个，所以，C=G=540个。所以，一个目的基因有胞嘧啶脱氧核苷酸540个。扩增4代可产生16个DNA分子，根据DNA半保留复制原则，其中有一个DNA分子“相当”于亲代的DNA。所以，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸数为（16-1）*540=8100个。5、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应6、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③AD二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基本质启动(终止)子启始(终止)密码子三.将目的基因导入受体细胞1.转化：2.方法：将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③过程：④优点经济和有效（2）基因枪法（3）花粉管通道法2、将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞①原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少②方法：用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子四、目的基因的检测与鉴定导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？不一定，需要检测1、鉴定——分子水平的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因基因探针：指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子方法——DNA分子杂交技术变性变性1、鉴定——分子水平的鉴定变性方法——分子杂交技术（2）检测目的基因是否转录出了mRNA探针15N15N转基因生物的mRNA1、鉴定——分子水平的鉴定提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质出现杂交带脱分化组织培养不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？2、鉴定——个体水平的鉴定抗虫、抗病接种实验，活性比较实验例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。变式迁移4．下列技术中不是依据DNA分子杂交原理的是()A．检测目的基因是否导入了受体细胞B．检测目的基因是否转录了mRNAC．检测目的基因是否翻译合成蛋白质D．快速灵敏地检测饮用水中病毒的含量点评：(1)涉及目的基因的检测与鉴定习题时，应注意审题，辨清是要求从“分子水平”还是从“个体水平”。(2)DNA探针及其应用①DNA探针是指用荧光或放射性同位素标记的DNA分子，其应用依据的原理是DNA分子杂交。②应用：DNA探针可用来检测DNA或RNA分子，因此其应用广泛，如a．从基因文库中准确提取目的基因。b．检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因和检测目的基因是否转录出了mRNA。c．鉴定物种亲缘关系。d．疾病的诊断和治疗。e．环境监测。归纳:基因工程的基本操作程序1.获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成2.构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因3.将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法4.目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：变式迁移3．采用基因工程方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()①将毒素蛋白质注射到棉花受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到受精卵中③将编码毒素蛋白质的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞再进行组织培养④将编码毒素蛋白质DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A．①②B．②③C．③④D．①④P10点评：(1)农杆菌转化法中有二次拼接和二次导入。第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒上T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA进入受体细胞。(2)因为动物体细胞的全能性受到一定限制，故一般将目的基因导入动物的受精卵或卵细胞，而不是体细胞；而植物体细胞的全能性相对容易表达，故一般将目的基因导入植物的体细胞，然后再通过植物组织培养技术获得转基因植株。练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术，该技术的核心是和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。答案：（1）aa（2）基因枪法（花粉管通道法）（3）植物组织培养（1分）脱分化（去分化）再分化（4）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）①基因组文库的构建（2）基因文库的构建方法