基因工程的基本操作程序主要包括

专题1基因工程点点生物学教学点点生物学教学基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定点点生物学教学点点生物学教学步骤一：目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。点点生物学教学目的基因的获得从基因文库获得基因文库利用PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库已知序列未知序列点点生物学教学•哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。点点生物学教学点点生物学教学3）从基因文库中获取目的基因：基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(genelibrary)基因组文库:基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.部分基因文库:基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.点点生物学教学点点生物学教学点点生物学教学用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程的研究都很有用。点点生物学教学人工合成已知其序列已知其mRNA的序列已知其翻译产物的氨基酸序列点点生物学教学步骤二：基因表达载体的构建1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。点点生物学教学点点生物学教学•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞---转化点点生物学教学①直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。（1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。（3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。②间接导入法常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。（1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。（2）λ噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基因的载体。（3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和λ噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。点点生物学教学1.将目的基因导入植物细胞其他方法：基因枪法，花粉管通道法点点生物学教学2.将目的基因导入动物细胞显微注射法点点生物学教学3.将目的基因导入微生物细胞大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。点点生物学教学1）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。2）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。点点生物学教学步骤四：目的基因的检测与鉴定四环素抗性基因氨苄青霉素抗性基因点点生物学教学四、目的基因的检测与鉴定1、检测与鉴定的目的目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性检测目的基因是否插入了转基因生物的染色体DNA上2、检测目的基因是否转录出了mRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质另外：个体生物学水平的鉴定点点生物学教学思考：检测mRNA是否合成，可以用分子杂交的方法吗？##检测目的基因是否翻译成蛋白质—抗原—抗体杂交##个体生物学水平的鉴定——点点生物学教学不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。•受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。点点生物学教学点点生物学教学前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。点点生物学教学多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。点点生物学教学寻根问底——（1）为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？提示：构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。点点生物学教学寻根问底：将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。点点生物学教学1.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。2.β-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？寻根问底：点点生物学教学（1）从小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β-珠蛋白基因已进入其中。（4）培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。点点生物学教学思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；点点生物学教学（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。点点生物学教学3.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。点点生物学教学1为了培育节水高产品种，科学家将大麦中与抗旱节水有关的基因导入小麦，得到转基因小麦，其水分利用率提高了20%。这项技术的遗传学原理是A．基因重组B．基因突变C．基因复制D．基因分离巩固练习点点生物学教学2利用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因培育的抗虫棉是否成功，最好检测A．是否有抗生素产生B．是否有目的基因表达C．是否有抗虫的性状出现D．是否能分离到目的基因巩固练习点点生物学教学3水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中天冬氨酸、甘氨酸和丝氨酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是A．促使目的基因导入受体细胞B．促使目的基因在受体细胞内复制C．使目的基因容易被检测出来D．使目的基因容易成功表达巩固练习点点生物学教学4根据mRNA的信息推出获取目的基因的方法是（）A、用DNA探针测出目的基因B、用mRNA探针测出目的基因C、用mRNA反转录形成目的基因D、用PCR技术扩增mRNA巩固练习点点生物学教学5PCR技术扩增DNA,需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥巩固练习点点生物学教学6获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）A、从基因组文库中获取B、从cDNA文库中获取C、从含目的基因生物细胞中获取D、利用PCR技术获取巩固练习点点生物学教学7下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（）A、我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻。B、我国科学家将苏云金杆菌的某些基因转移到棉花体内，培育出抗虫棉。C、我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒。D、我国科学家通过体细胞克隆技术培育出克隆牛。巩固练习点点生物学教学8有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制性内切酶只在获得目的基因时才使用B、DNA连接酶可以切断磷酸二酯键C、质粒都可以做载体基因工程都能定向改变生物的性状巩固练习点点生物学教学9科学家将控制某药物蛋白合成的基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中,发育后的