基因工程的概念

Chapter15RecombinantDNAandGeneticEngineering15.1基因工程的概念一、基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(geneengineering)常和以下名称混用•遗传工程(geneticengineering);•基因克隆(genecloning);•分子克隆(molecularcloning);•基因操作(genemanipulation);•重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)•克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.15.1基因工程的概念二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。15.1基因工程的概念三、基因工程的应用•医药：生物制药；基因治疗；人工器官•农业和畜牧业转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、高品质新品种转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质•轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶•环境污染治理；废物利用；污染物生物降解15.1基因工程的概念供体细胞目的基因载体重组DNA分子转化细胞受体细胞多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断转基因动物(畜牧业、渔业生物反应器)转基因植物(农业、林业生物反应器)冶金、环保轻工、食品15.1基因工程的概念转基因植物15.1基因工程的概念转基因动物作为生物发生器15.1基因工程的概念15.2基因工程中的工具酶•限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割•DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化•核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割•核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成•核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接•核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰•其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等15.2基因工程中的工具酶一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途15.2基因工程中的工具酶一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列；并在特定切点切割．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”来源：种类：作用：主要是微生物4000种。15.2基因工程中的工具酶（一）、限制修饰系统的种类1.Ⅰ型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.Ⅱ型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.Ⅲ型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。15.2基因工程中的工具酶（二）、限制性内切酶的定义、命名1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指Ⅱ型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRI15.2基因工程中的工具酶（三）、限制酶的特点1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG２）富含ＧＣ３）对称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ15.2基因工程中的工具酶2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子15.2基因工程中的工具酶EcoRⅠ5’-G-A-A-T-T-C-3’3’-C-T-T-A-A-G-5’Palindrome5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAPHOG-5’CohesiveEnds(StickyEnds)15.2基因工程中的工具酶SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’BluntEnds15.2基因工程中的工具酶３）平齐末端SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG15.2基因工程中的工具酶（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG15.2基因工程中的工具酶（五）、限制酶的用途1.DNA重组2.限制酶（物理）图谱绘制3.突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.均为单体，分子量为47—108kD。15.2基因工程中的工具酶RestrictionMaps(a)15.2基因工程中的工具酶RestrictionMaps(b)15.2基因工程中的工具酶M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE15.2基因工程中的工具酶二、DNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polⅠ）1.E.coli的DNA聚合酶系统PolⅠ参与DNA修复,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polⅡ同上具3’→5’外切酶活性polⅢ参与DNA复制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性2.E.colipolⅠ的特点1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响3）外切酶活性15.2基因工程中的工具酶3.用途1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段15.2基因工程中的工具酶三、连接酶（一）、T4DNA连接酶1.特点：只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基2.用途：1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多15.2基因工程中的工具酶5’-AAGCTT-3’5’-AOHPAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAPHOA-5’HOATTCGAP退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’T4DNA连接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’或5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA连接酶的连接反应(两种插入方向)+Thepolymerasechainreaction(PCR)：toamplifyasequenceofDNAusingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.1985年，美国Cetus公司和加利福尼亚大学联合创建了一种核酸体外扩增技术。15.3PolymeraseChainReaction•Denaturation（变性）:ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃•Primerannealing（引物退火）:Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.•Polymerization(elongation,extension):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg++15.3PolymeraseChainReaction15.4Vectors•一、质粒的一般生物学特性；•二、质粒DNA的分离与纯化；•三、质粒载体的构建及类型；•四、常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性（一）、质粒DNA1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。（二