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基因工程的酶学基础限制性核酸内切酶ＤＮＡ连接酶DNA聚合酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶。寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象：人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。•R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解•限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。•根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ的特点，可以将限制性内切酶分为三类：Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、Ⅲ型酶Ⅰ型酶：1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需Mg++、S-腺苷酰-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。Ⅱ型酶1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg++的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。•识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。•许多Ⅱ型酶切割ＤＮＡ后，可在ＤＮＡ上形成粘性末端，有利于ＤＮＡ片段的重组。Ⅲ型酶这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3’端24~26bp处切开ＤＮＡ，所以它的切割位点也是没有特异性的。Ⅱ型酶的基本特性1.在DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。2.两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的3.因此，断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。核酸内切酶作用后的断裂方式粘性末端：两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。具有3’-OH（Pst1），或5’-OH(EcoR1)的粘性末端。Pst1EcoR15’CTGCAG3’5’GAATTC3’3’GACGTC5’3’CTTAAG5’平末端两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。同裂酶（isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶(CCGG)，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时HpaⅡ不能进行切割，而MspⅠ可以。同尾酶（isocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。杂种位点（hybridsite）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCACCTAGGACTAGT杂种位点（hybridsite）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。BamHⅠGGATCCBclⅠTGATCACCTAGGACTAGT杂种位点：GATCC（BamHⅠ）CTAGT（BclⅠ）限制片断的末端连接作用分子间的连接：不同的DNA片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。分子内的连接：由同一片断的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。限制酶的特性a.限制酶识别靶序列同DNA的来源无关；b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。限制性核酸内切酶的命名原则：第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号。罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。例：EcoRI:来自于EscheriacoliRY13的第一个限制酶。影响核酸内切酶活性的因素：1.DNA的纯度：DNase的污染(Mg++)a.增加核酸内切限制酶的用量，b.扩大酶催化反应的体系（稀释），c.延长酶催化反应的保温时间。加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度。2.DNA的甲基化程度3.酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度37度。4.DNA的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA高29倍。核酸内切限制酶标准的缓冲液1.氯化镁、氯化钠或氯化钾：不正确的NaCl或Mg++浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变。2.Tris-HCl：维持最适的pH值（pH＝7.4）。3.β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）：维持酶的稳定性。4.牛血清蛋白（BSA）：维持酶的稳定性。核酸内切限制酶对DNA的消化作用1.核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用。2.核酸内切限制酶对DNA的局部消化完全的酶切消化：识别序列n个碱基的核酸内切限制酶，对DNA的切割能达到每隔4n切割一次的水平。局部酶切消化：不让核酸内切限制酶对大量的DNA消化完全，就可以获得平均分子量大小有所增加的限制片断产物，进行不完全的限制酶消化反应。a.缩短酶切的消化反应的保温时间b.降低反应的温度（37--4）结束酶的活性。3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断-----少（电泳-容易分离目的片断）大分子量的片断-----多（基因文库）ＤＮＡ连接酶（DNAligase）与分子的体外连接末端核苷酸转移酶（terminaltransferase）terminaldeoxynucleotidyltransferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA用途：1.催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。2.催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端：生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。3.用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。碱性磷酸酶：来自于大肠杆菌（bacterialalkalinephosphataseBAP）或小牛肠（calfintestinalalkalinephosphataseCIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身连接（或环化）时可进行脱磷酸反应。S1核酸酶：来自于稻谷曲霉，该酶只水解单链DNA，用于将粘性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。反转录酶（reversetranscriptase）这类酶来自于反转录病毒，它可以RNA为模板，催化合成ＤＮＡ。目前常用的有禽源（AMV）及鼠源（M-MLV）反转录酶两种。•体外连接的三种方式：1.用ＤＮＡ连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片断2.用Ｔ４ＤＮＡ连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用ＤＮＡ连接酶连接。3.先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用ＤＮＡ连接酶连接ＤＮＡ连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3’-羟基（OH）和5’-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。酶－－AMP（腺苷－磷酸）磷酸酰胺键DNA的腺苷酸复合物3’-OH对P原子作亲核攻击形成磷酸二酯键连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸(ppi)的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基）连接酶的来源1.DNA连接酶：大肠杆菌染色体编码的2.T4DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的DNA连接酶－－NAD+T4DNA连接酶－－ATPＴ４ＤＮＡ连接酶（DNAligase）该酶常从Ｔ４噬菌体的受感细胞中提取，是由Ｔ４噬菌体基因组所编码的，所以基因工程中常用的连接酶是Ｔ４连接酶。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来。DNA连接酶对具有粘性末端的DNA分子经退火后能很好地连接，对平末端的DNA分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。影响连接酶作用的因素1.反应温度：连接缺口的温度：37度连接粘性末端的最佳温度：4～15度2.Ｔ４ＤＮＡ连接酶的用量：平末端DNA分子的连接反应中，最适1～2个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10μmol~1mmol/L之间3.提高外源片断与载体的浓度的比值，（10～20倍）粘性末端DAN片断的连接由于具粘性末端的载体易发生自连。对载体的5’末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5’-P能与载体的3’-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5’-P的链不能进行连接，形成3’-OH和5’-OH的缺口。平末端DNA片断的连接1.T4DNA连接酶2.用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法同聚物加尾法用5’末端特异的核酸外切酶处理DNA片断在A和B分别中加入dATP和dTTP同聚物尾巴10~40个碱基同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，获得插入片断进行进一步的研究。衔接物连接法平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约10~20个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：CCGGATCCGGGGCCTAGGCC将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。HpaIIHpaIIBamHI或Sau3A衔接物（linker）是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。衔接物连接法双衔接物连接法的基本程序cDNA链的合成通过DNA聚合酶合成第二链加入SalI衔接物SI核酸酶作用后的末端单链突出序列，由Klenow补齐，加入第二衔接物EcolI在用DNA衔接物连接法时，如果待克隆DNA的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位