基因工程研究技术

基因工程研究技术Preparation,analysisandmanipulationofnucleicacidsandproteins所有的分子生物学技术都是基于对核酸和蛋白质性质研究的基础上发展的杂交：thebase-pairingcharacteristicsofDNAandRNAPCR：ThermophilicDNApolymeraseDNA克隆：DNApolymerase,restrictionendonucleasesandDNAligase1.核酸研究技术电泳分离：SeparationbyElectrophoresis限制性内切酶切割：CutbyRestrictionendonuclease杂交鉴定：IdentificationbyHybridizationPCR扩增：AmplificationbyPCRDNA克隆和基因表达：DNACloningandgeneexpressionDNA文库的构建和目的基因的筛选（ConstructionofDNAlibrary&screeningoftargetgene)基因组序列和分析：Genomesequence&analysis1.凝胶电泳是根据DNA和RNA的分子量大小、拓扑结构等性质进行分离一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率；电泳的迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。DNA、RNA由于其骨架中的磷酸基团呈离子化状态，带有负电荷，在电场中向正电极移动。线性DNA分子根据其分子量大小来分离。分子量大的DNA电泳速度比分子量小的DNA要慢。环状DNA的电泳速度与其拓扑结构相关。不同构型，相同大小分子量的DNA的电泳速度是：SCDNALDNAOCDNAGelmatrix(胶支持物)胶支持物是凝胶状的多孔物质，能允许DNA分子通过其内部的孔隙。琼脂糖（Agarose）聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）溴化乙锭（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。当DNA和RNA用EB充分处理之后，其荧光强度与其分子量大小呈正比9琼脂糖(Agarose):(1)分离效果比聚丙烯酰胺差,(2)能够分离大分子DNA，分子量高达几十Kb1kb0.5kb2kb3kb4kb10聚丙稀酰胺(Polyacrylamide):(1)分离能力高，能够分辨相差一个碱基或者一个碱基对的DNA或者RNA分子(2)只能分离小分子量大样品(1toafewhundredbp).11(1)DNA分子的迁移方向随电场方向的周期性变化而不断改变.(2)根据DNA地分子量大小、拓扑结构来分离样品.(3)用来分离大分子的样品，分子量超过50Kb，甚至高达几M.Pulsed-fieldgelelectrophoresis(脉冲场电泳)Switchingbetweentwoorientations:thelargertheDNAis,thelongerittakestoreorient(1)RNA与DNA类似，带有负电荷；(2)RNA是单链分子，很容易自发形成分子内的二级结构和三级结构，影响了电泳分离效果；(3)用乙二醛处理RNA，阻止RNA的碱基配对，使得RNA与ＤＮＡ一样，电泳迁移率与分子量大小相关RNA也可以用电泳方法分离2.限制性内切酶在特定位点切割DNA分子识别位点粘性末端平末端同裂酶同尾酶3.DNA杂交-确定特殊的DNA分子杂交（Hybridization):不同来源的单链DNA或者RNA通过碱基配对形成互补结构的过程探针-Probe探针：一段带有特殊标记的核苷酸序列，可以用来从混合的核苷酸中寻找含有与其序列互补的核苷酸序列。将要用探针杂交的混合核苷酸可以在电泳分离后的凝胶上，也可以在一个文库的不同的克隆中。探针在杂交之前需要进行标记，以便于在探针与目标序列杂交后能够被检测出。探针的标记Radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyradioactivity.Non-radioactivelabeling:displayand/ormagnifythesignalsbyantigenlabeling:antibodybinding–enzymebinding-substrateapplication(signalrelease)Southernblotting：将变性处理的后的DNA片段进行凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素薄膜，再用放射性标记的探针进行杂交以显示这些DNA，这种技术成为Southernblotting。Northernblotting：将RNA从琼脂糖凝胶电泳转移至转移至硝酸纤维素薄膜，再用放射性标记的探针进行杂交的技术。其原理与Southernblotting类似。探针杂交可以确认电泳分离后的DNA和RNANorthern/SouthernblotanalysisgelmembraneElectrophoresisblottingHybridizationSouthernandNorthernblottingDNAonblotRNAonblot1.GenomicDNApreparationRNApreparation2.Restrictiondigestion-3.Denaturewithalkali-4.Agarosegelelectrophoresis5.DNAblotting/transferandfixationRNA6.Probelabeling6.Hybridization(temperature)7.Signaldetection(X-rayfilmorantibody)WesternblottingWesternblotting：又称为蛋白质印迹法，用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白质的技术。操作程序与Souternblotting类似。先将蛋白质经过SDS-PAGE电泳分离，然后转移至醋酸纤维素薄膜之类的固体支持物上，通过专一性抗体探测目标蛋白质；随后用标记的第二抗体检测在印迹中是否存在免疫复合物（一抗与抗原的复合物）。22BlottypeTargetProbeApplicationsSouthernDNADNAorRNAmappinggenomicclonesestimatinggenenumbers,etcNorthernRNADNAorRNARNAsizesandabundance(geneexpressionlevel)WesternProteinAntibodiesproteinsizeandabundance(geneexpressionlevel)ComparisonofSouthern,NorthernandWesternbolthybridization4.聚合酶链式反应(PCR)PCRistousedtoamplifyaDNAsequenceusingapairofprimerseachcomplementarytooneendoftheDNAtargetsequence.•Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃•Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.•Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesupdNTPsandrequiredMg2+.ThePCRcycle:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.DenaturationPrimerannealingPolymerizationNestedPCR:利用嵌套引物提高PCR扩展的准确性FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest反向PCR-reversePCR先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸内切限制酶，从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子，然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。1.用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA；2.产生大小不同的线性DNA片段群体，其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过2~3kb，经连接后重新环化；3.按靶序列设计的一对引物与互补序列退火结合，其延伸方向如箭头所指；反转录PCR：Reversetranscriptase(RT)-PCRPCR技术不仅可以扩增DNA模板，还可以扩增反转录成cDNA形式的RNA。这种在mRNA反转录之后进行的PCR成为反转录PCR。反转录PCR：Reversetranscriptase(RT)-PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCRPCR诱变(PCRmutagenesis)通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响；也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。通过重叠延伸PCR进行基因的定点突变。1.根据靶DNA序列设计的一对互补的突变引物，在相同的位点具有相同的碱基突变；2.分别以两个突变引物进行PCR扩增；3.除去未参与扩增的多余引物，由于具有重叠序列，经过变性退火形成异源双链分子，其中一种结合方式不能延伸；4.正确配对的异源双链分子利用靶DNA两端的通用引物扩增到突变位点位于靶DNA中间的序列5.DNA克隆和表达TheabilitytoconstructrecombinantDNAmoleculesandmaintainthemincellsiscalledDNAcloning.34ProcessesofDNAcloning：1.FormtherecombinantDNAmolecules(重组DNA)byinsertingyourinterestedDNAfragmentsintoapropervector(载体).(Requirerestrictionenzymesandligase)2.Transform(转化)therecombinantDNAmoleculesintocompetentcells(感受态细胞).3.PropagationofthecellscontainingtherecombinantDNAtoformaclone(克隆),asetofidenticalcellscontainingthesamerecombinantDNA.4.Selectthedesiredclonesusingtheselectivemarker.用同样的限制性内切酶处理外源插入基因和载体；利用连接酶将切割好的插入片段和载体连接起来；将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中；在含有四环素的LB平板上培养大肠杆菌细胞质粒和载体DNA文库DNA文库：由一组DNA的随机克隆片段组成，每个单独的片段都连接在一个载体上。基因组文库：把某种生物的基因组DNA切割成适当大小的片段，这些片段分