基因工程研究生11

目录高等教育出版社1南昌大学医学院万福生GeneticEngineering基因工程目录高等教育出版社2基因工程（geneticengineering）是人们在对自然界基因重组和基因转移的认识上发展起来的一门分子生物学技术。基因工程的重要特点是在分子水平上操作，细胞水平上表达。它的诞生和发展，不但为生命科学的理论研究提供了崭新的技术手段，而且为医学领域的发展开辟了广阔的前景。目录高等教育出版社3生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录高等教育出版社4第一部分DNA的重组DNARecombination目录高等教育出版社5DNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)目录高等教育出版社6发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组目录高等教育出版社7Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)目录高等教育出版社8片段重组体（见模型图左边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体（见模型图右边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。目录高等教育出版社9内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´目录目录高等教育出版社10Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组体拼接重组体目录目录高等教育出版社11二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。目录高等教育出版社12可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子目录高等教育出版社13（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。目录高等教育出版社14例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。目录高等教育出版社15目录目录高等教育出版社16（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。目录高等教育出版社17λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例目录目录高等教育出版社18目录目录高等教育出版社19三、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。例（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。目录高等教育出版社20例（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录高等教育出版社21hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。目录高等教育出版社22H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变目录高等教育出版社23例（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC目录高等教育出版社24重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段目录高等教育出版社25V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目录目录高等教育出版社26四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。目录高等教育出版社27插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座目录高等教育出版社28插入序列的复制性转座目录目录高等教育出版社29转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座目录高等教育出版社30目录高等教育出版社31由转座子介导的转座目录目录高等教育出版社32第二部分重组DNA技术DNARecombinationTechnique目录高等教育出版社33重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆目录高等教育出版社34技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）目录高等教育出版社35DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。目录高等教育出版社36重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉。目录高等教育出版社37第二节基因工程的物质基础第三节基因克隆的基本过程第四节克隆基因的表达第五节基因工程技术与医学的发展第一节基因工程的基本原理目录高等教育出版社38第一节基因工程的基本原理一、基因工程技术的诞生及意义二、基因工程技术的基本原理目录高等教育出版社39基因克隆的基本原理及过程载体目的基因重组DNA分子细菌转化扩增目录高等教育出版社40第二节基因工程的物质基础一、工具酶（一）限制性核酸内切酶（二）DNA聚合酶(三)DNA连接酶(四)其它DNA修饰酶目录高等教育出版社41（一）限制性核酸内切酶限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制性核酸内切酶分为三类，在基因工程操作中所说的限制酶，通常指Ⅱ类限制性核酸内切酶。目录高等教育出版社42定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶,简称限制酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目录高等教育出版社43作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）目录高等教育出版社44第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录高等教育出版社45Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录高等教育出版社46BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目录高等教育出版社47同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ目录高等教育出版社48同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA目录高等教育出版社49限制酶的性质和作用特点限制酶识别序列的长度一般为4-6个核苷酸。切割DNA分子中的磷酸二酯键，产生5´-P、3´-OH的DNA片段。限制酶切割DNA分子形成黏性末端(stickyend)和平末端或钝末端(bluntend)两种。目录高等教育出版社505´…CTGCAG…3´PstⅠ识别序列3´…GACGTC…5´形成3´-OH黏性末端5´…GAATTC…3´EcoRⅠ识别序列3´…CTTAAG…5´形成5´-P黏性末端5´…AGCT…3´AluⅠ识别序列3´…TCGA…5´切割后形成平末端目录高等教育出版社51限制性核酸内切酶的用途:①改造和构建新质粒；②建立DNA物理图谱；③基因组DNA同源性研究；④基因克隆；⑤DNA分子杂交及序列分析；⑥制备DNA放射性探针；⑦DNA甲基化碱基的