基因工程菌稳定性分析

GXU基因工程菌稳定性分析GXU基因工程菌稳定性分析Slide1第一节基因工程菌的概述第二节质粒载体不稳定现象及类型第三节提高质粒稳定性的方法第四节影响质粒载体稳定性的主要因素第五节对NHase重组质粒稳定性分析GXU第一节基因工程菌的概述一、基因工程菌的定义基因工程菌(GeneEngineeringBacteria)是利用基因工程技术，将外源目的基因导入宿主细胞使其表达所需蛋白的重组菌。二、基因工程菌构建的基本路线目的基因获取-目的基因扩增-基因重组-重组载体导入受体菌-筛选导入成功的受体菌GXU第一节基因工程菌的概述三、质粒的稳定性问题基因工程技术是生物技术的核心和关键，通过载体向受体细胞或细菌转入目的基因，从而使其表达一系列与人类健康有关的重要物质，如抗生素、氨基酸、疫苗等，在医药、环境治理等行业有广阔应用前景。但是，质粒的稳定性问题是基因工程技术工业化的瓶颈。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型一、质粒载体不稳定的现象：克隆有外源基因的质粒载体转移到大肠杆菌受体细胞之后，会产生一系列的生理效应，影响到自身的稳定性；可能引起形态学上的变化：丝状现象和脆性增加；产生无质粒的突变体或拷贝数低的突变体；结构重排导致无法正常表达的突变体。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型二、质粒载体不稳定性的类型结构不稳定指结构(序列)不稳定性,即重组质粒上某一区域的DNA序列发生插入、缺失、重排和修饰等现象,导致其表观生物学功能的丧失;分离不稳定指细胞分裂的过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增殖为无质粒的优势群体。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型1.结构不稳定原因：DNA的丢失，插入和重排。人工构建的多个串联启动子的质粒载体容易发生丢失作用。寄主染色体及质粒载体的IS因子或转位因子，同样也会引起结构的不稳定性。共同特征：同向重复序列之间的同源重组（shortdirectrepeat).例如：用含有酪氨酸操纵子的多拷贝质粒载体转换大肠杆菌tryR菌株时，由于IS1因子的插入效应，结果产生出具有插入或者缺失的修饰型的质粒载体。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型2.分离不稳定原因：细胞分裂过程中的质粒的不平均分配。由于缺陷性分配（defectivepartitioning）所造成的质粒的丢失现象叫做质粒分离的不稳定性。质粒稳定遗传的两个必要条件：一、平均每个时代每个质粒至少发生一次复制；二、细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须分配到两个子细胞中去。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型三、质粒拷贝分配到子细胞的途径质粒拷贝分配到子细胞的途径可分为主动分配和随机分配两种不同的方式。1主动分配的方式有两种:平均分配--每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝配对位点分配--只有一对质粒呈主动分配，其他的随机分配GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定。GXU第二节质粒载体不稳定现象及类型2随机分配在细胞分裂过程中质粒拷贝数在两个子细胞中随机分配。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素1.新陈代谢符合对质粒载体稳定性的效应质粒载体增加给宿主细胞DNA复制效应曲线。即宿主细胞生长速度与质粒载体的分子量的大小成正比，克隆的外源DNA段越大，寄主细胞生长缓慢的时间就越长。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素2.拷贝数差异对质粒载体稳定性的影响差异：同样的大肠杆菌培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的，这种不同的细胞个体之间的质粒载体拷贝数差异程度，简称差度。无质粒载体细胞的速度是由分裂细胞中的质粒载体拷贝平均值数决定的。差度是影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定的原因之一。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素具有低差度分布特性的质粒载体相当的稳定性，具有高差度分布特性的质粒载体稳定性较差。位于后者的这种分布的低拷贝数的一段产生无质粒载体细胞的频率相当高。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素3.寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应质粒寡聚体，其稳定性比单体差，同样是造成质粒不稳定性的重要原因之一。寡聚化作用普遍存在于含有大分子量插入片段的克隆载体。实验证明，pBR322派生载体中，寡聚化程度与插入片段大小存在相关性。决定大肠杆菌培养物中含质粒寡聚体细胞的比例有两种主要的因素：一、质粒DNA分子间的重组频率；二、含质粒寡聚体细胞生长速率。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。实验观察表明，在重组缺陷(rec-)的大肠杆菌寄主细胞中，基因工程常用载体pBR322和pUC当以单体形式存在时最稳定。随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性就相应的下降。GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素菌体生长数率对质粒拷贝数和质粒稳定性有一影响。高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。生长数率/h0.20.4质粒拷贝数10.5950400β-半乳糖苷酶工程菌的连续养GXU第三节影响质粒载体稳定性的主要因素一般情况下,质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。因此在质粒不稳定性的研究过程中,人们关注最多的,通常是质粒的分离不稳定性。GXU第四节提高质粒稳定性的方法高密度培养基因工程菌选择培养基周期操作固定化基因工程菌GXU第四节提高质粒稳定性的方法1.高密度培养对基因工程菌稳定性的影响为了提高质粒稳定性，工程菌培养采用两阶段培养法：先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。GXU第四节提高质粒稳定性的方法由于第一阶段先使菌体生长至一定密度，外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。GXU第四节提高质粒稳定性的方法有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。GXU第四节提高质粒稳定性的方法2.基因工程菌的构建对质粒稳定性的影响一般,质粒的结构不稳定性可以通过宿主菌株的谨慎和恰当的选用来消除。宿主菌株通常有苏云金芽胞杆菌、根瘤菌、酒精酵母和大肠杆菌等。例如，大肠杆菌获得外源基因的高效表达：可以选用T7、PRPL、Ptac等强启动子,通过对翻译增强序列和转录终止序列的改进和优化;可以按照大肠杆菌系统偏爱的密码子和mRNA二级结构进行目的基因的设计和合成。GXU第四节提高质粒稳定性的方法3.选择培养基对质粒稳定性的影响常用选择性培养基对基因工程菌进行培养,这样可提高带质粒菌的竞争力。一般是在质粒上引入抗生素基因,再向培养基中加入抗生素,这对提高质粒分离稳定性非常有效。GXU第四节提高质粒稳定性的方法4.周期操作对基因工程菌质粒稳定性的影响一是在这种瞬变的环境中,重组细胞快速地适应了该环境,从而降低了无质粒细胞的相对生长优势;二则可能是在这种瞬变的环境下,细胞被诱导以保持较高的质粒拷贝数,而质粒拷贝数的增加降低了由于随机分配而导致质粒损失的概率。GXU第四节提高质粒稳定性的方法5.固定化基因工程菌对质粒稳定性的影响质粒的不稳定性对基因工程菌的培养和产物的生产有着极大的影响,将基因工程菌固定化后培养可提高基因工程菌的稳定性、生物量和克隆基因产物的产量。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析对成功构建的腈水合酶(NitrileHydratase,NHase)高表达的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETNHM(Kanr)的重组质粒pETNHM在重组菌株中的质粒稳定性进行了研究分析。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析1.质粒pETNHM的结构稳定性质粒pETNHM是将α-亚基起始密码子突变的诺卡氏菌腈水合酶基因插入商品化的pET28a(+)(Novagen公司)质粒载体而得到的，插入位点为NcoI和BamHI。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析在LB培养基中对重组E.coliBL21(DE3)/pETNHM每隔6h进行反复的传代培养,约60代后收获细胞提取质粒,并对初始构建的质粒和传代培养后的质粒分别以EcoT22I单酶切及NcoI和BamHI双酶切，然后琼脂糖凝胶电泳。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析由图可见,连续传代60代后收获的质粒样品采用EcoT22I单酶切及NcoI和BamHI双酶切后,分别获得了与初始质粒完全相同的预期长度基因片段(EcoT22I单酶切:4.1kb、2.2kb和0.3kb,其中0.3kb的片断因为太小而在琼脂糖凝胶电泳中检测不到;NcoI和BamHI双酶切:5.3kb和1.3kb)。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析进一步将连续复制60代后的质粒转入宿主E.coliBL21(DE3),并对重组菌进行腈水合酶的诱导表达,结果表明腈水合酶能够正常表达。证明质粒pETNHM确实具有良好的结构稳定性,即使经过长时间连续复制,也没有产生DNA序列的明显自发突变。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析质粒的分离不稳定性是质粒不稳定性的主要因素,历来受到学者们的高度重视。大量研究表明,宿主的新陈代谢负荷、质粒的寡聚化效应及在缺陷性分配过程中造成的拷贝数差度等,均是产生无质粒细胞的重要因素,而不利的环境条件及无质粒细胞的生长竞争等则是进一步扩大质粒分离不稳定性的重要原因。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析2.质粒pETNHM的分离不稳定性及抗生素选择压力的影响抗生素的选择压力是保证质粒分离稳定性的重要因素。分别在LB和LBK培养基中对重组菌BL21(DE3)/pETNHM进行反复的传代培养,以考察重组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时Kan的添加对质粒稳定性的影响。为了保证所有的细胞均具有分裂能力,确定传代时间为6h,即当细胞处于对数生长后期时进行传代。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析在没有抗生素选择压力的L培养基中,当重组菌细胞连续分裂约48次左右时,质粒就开始丢失,含质粒细胞(P+)的百分率逐渐下降;当世代数增大到约66代时,质粒丢失率接近90%,说明质粒pETNHM具有分离不稳定性,宿主细胞的连续高速分裂将导致质粒的丢失。而在LBK培养基中,由于抗生素Kan选择压力的存在,含质粒细胞P+菌的百分率在传代过程中一直保持恒定。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析3.质粒特性对pETNHM分离不稳定的影响在重组菌细胞中,质粒载体的拷贝数是影响质粒分离不稳定性的重要因素。对于松弛型质粒载体,一般情况下,伴随着细胞的分裂,质粒以随机方式分配到子细胞中,质粒拷贝数越高,出现无质粒载体细胞的概率就越低,质粒也就越稳定。而质粒载体的寡聚化效应会导致质粒载体的拷贝数大大降低,从而通常会加重质粒的分离不稳定性。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析分别收获在LB培养基中连续传代培养30代、60代及经过诱导大量表达腈水合酶的BL21(DE3)/pETNHM细胞，利用试剂盒提取质粒，进行0.7%的琼脂糖凝胶电泳，并以原质粒为对照，电泳。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析重组质粒pETNHM除了在4.8kb处(理论长度6.6kb,由于环状质粒形成超螺旋,所以出现在4.8kb位置)出现条带以外,还在10kb左右出现了强条带。回收纯化10kb左右的质粒DNA,分别采用NcoI和BamHI对其进行单酶切,酶切后电泳。GXU第五节对NHase重组质粒稳定性分析酶切后仅得到一条长度均为6.6kb的线性质粒条带,是重组质粒pETNHM长度的理论值,说明酶切前的