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国内外利用不同受体细胞开发生物反应器的研究进展情况摘要：利用受体作为生物反应器生产外源蛋白,包括抗体、疫苗、药用蛋白等较之其他生产系统具有很多优越性植物生物反应器是生物反应器研究领域中的一大类,是指通过基因工程途径,以常见的农作物作为化学工厂，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其他一些次生代谢产物等生物制剂的方法。关键词：受体细胞;转基因;生物反应器；基因药物一受体细胞作为生物反应器一、酿酒酵母是第一个用于基因药物表达的酵母菌，遗传背景已相当清楚：有17条染色体，1996年完成其全基因组测序，基因组为12068kb，阅读开放开架5887个，编码约6000个基因，比单细胞的原核生物和古细菌大一个数量级。受体细胞举例：酿酒酵母GRF18应用1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。FDA批准的第一个基因工程疫苗就是酿酒酵母表达的乙肝疫苗（Merck公司）上市产品还有人胰岛素（丹麦Novo－Nordisk公司）和人粒细胞集落刺激因子（Immunex公司）等存在问题1、外源基因表达水平不高。原因：（1）密码子使用的偏向性（tRNA与外源基因密码子不匹配）（2）乙醇发酵途径活跃导致生物大分子合成普遍受到抑制（3）质粒的不稳定性2、重组异源蛋白超糖基化修饰二、巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）是近年来发展最为迅速，应用最为广泛的酵母细胞。是一种甲基营养菌，能在相对较为廉价的甲醇培养基中生长。优点除具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点：1、具有目前最强，调控机理最严格的启动子之一－乙醇氧化酶AOX1基因启动子,外源蛋白表达量高（一般500-4000mg/L，最高为破伤风毒素C达到12g/l）。2、表达质粒能在基因组的特定位点稳定整合。3、蛋白产物糖基化修饰作用大多数情况下接近哺乳动物细胞且可直接以天然可溶形式分泌到胞外。缺点发酵周期长，要添加甲醇分子生物学基础不清楚，遗传改造难度大。应用生产重组真核药物蛋白：近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。药物蛋白已有20多种，见李元《基因工程药物》P52表。如人IL－2、人血清白蛋白、TNF、HBsAg、EGF、破伤风毒素C片断、人巨细胞病毒抗原、抗凝血因子水蛭素衍生物等，有些即将进入市场。常用毕氏酵母菌KM71和GS115:都具有HIS4营养缺陷标记。GS115茵株：具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；KM71菌株：AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型共同特点:为组氨醇脱氢酶缺陷株，与带有his标记基因的表达质粒配合使用三、乳酸克鲁维酵母具有可稳定存在的附加体型质粒pKD1载体及高拷贝整合型质粒pMIRK1外源基因表达水平比酿酒酵母高，如由重组乳酸克鲁维酵母合成的人IL－1β是重组酿酒酵母的80－100倍。四、多型汉逊酵母表达系统蛋白糖基化修饰作用接近哺乳动物细胞。也是一种甲基营养菌。举例：利用重组酵母生产乙肝疫苗第一代乙肝疫苗：病毒携带者体内提取存在问题：1、来源有限2、提取过程复杂3、致病潜在危险4、成本高第二代乙肝疫苗－重组乙肝疫苗第一阶段：大肠杆菌重组乙肝疫苗。20世纪70年代末尝试用大肠杆菌表达乙肝表面抗原HBsAg，但表达水平极低第二阶段：酿酒酵母重组乙肝疫苗。起始于20世纪80年代初，将HBsHg（或s多肽）的编码序列置于ADH1（酿酒酵母的乙醇脱氢酶1基因）启动子或PGK（磷酸甘油酯激酶基因）启动子后面，表达出具有免疫活性的非糖基化HBsHg。目前已作为乙肝疫苗商品化，商品名为Recombivax－B或Engerix－B。第三阶段：巴斯德毕赤酵母重组乙肝疫苗HBsAg基因稳定整合在巴斯德毕赤酵母染色体上表达产物量比在酿酒酵母中高1倍，并且表达蛋白效价高出酿酒酵母数十倍。常用哺乳动物表达细胞能在培养基中无限生长的哺乳动物细胞系。一般为与正常细胞生理特性基本接近、无平面接触抑制特性的肿瘤细胞系或异倍体连续细胞系有限细胞系和无限细胞系有限细胞系（finitecellline）：正常细胞经过多次传代后，一般可连续培养30～50代，就会逐渐失去增殖能力，也就是说它们只能生长有限的时间，经过若干传代培养后将老化死亡，把这类细胞称为有限细胞系。无限细胞系（infinitecellline）或连续细胞系（continuouscellline）：当细胞经过自然或人为的因素转化为异倍体后，能变为无限细胞系，没有分裂次数的限制。药物生产应用的主要细胞系非洲绿猴肾细胞（COS）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、小仓鼠肾细胞（BHK）、人胚胎肾细胞（HEK－239）、C127用于基因瞬时表达：COS、BHK、HEK－239用于基因稳定表达：CHO一、CHO细胞（Chinesehamsterovarycells）细胞贴壁培养和悬浮培养（二）优点1、外源基因整合到宿主细胞后能稳定保持；2、可分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。3、蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。4、培养条件要求低。对剪切力和渗透压有较高的忍受能力；能在无血清的条件生长。（三）应用有多个衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。采用二氢叶酸还原酶（DHFR）的缺陷株（*CHO/dhFr）表达的药物有人组织性纤溶酶原激活剂tPA、IFN－、IFN－、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ等已投放市场。可在在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平，使外源基因高效表达。二、BHK细胞（一）一般特性：分离自幼仓鼠的肾脏（babyhamsterkidney,BHK）成纤维样细胞，非整倍体，2n=44。（二）应用：用于增殖病毒制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ，Bayer的KogenateFS、AventisBehring的Helixate分别于1989和1994被FDA获准上市，1999年FDA批准NovoNordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市，用于治疗血友病。三、C127细胞（一）一般特性：分离自小鼠乳腺肿瘤上皮样细胞，贴壁型生长。被牛乳头瘤病毒（bovinepolyomavirus，BPV）DNA载体转染后，细胞形态发生明显变化。（二）常用细胞系：C127：LT细胞系：生长密度高，表达组成型大T抗原。C127I细胞：适合于牛乳头瘤病毒DNA载体的转化。（三）应用：已表达多种外源基因，Serono公司生产rhGH（Saizen,Zorbtive）于1996年被FDA已被批准进入市场。四、杂交瘤细胞（一）一般特性：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系；悬浮生长型容易转染和培养，能在无血清培养基中高密度悬浮生长；（二）常用细胞系：SP2/O、J558L和NS0等。（三）应用：制备抗体、表达其他外源蛋白如tPA等。五、Vero细胞（一）一般特性：分离自成年非洲绿猴肾成纤维细胞，贴壁依赖性，为连续细胞系。多倍体核型，66%细胞的2n=60（二）常用细胞：VeroE6（三）应用：1、增殖多种病毒生产疫苗，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等。2、表达蛋白质药物3、病毒的检测六、COS细胞常用昆虫表达细胞（家蚕）Sf21和Sf-9来源：秋黏虫（Spodopterafrugiperda，fallarmyworm)卵巢细胞特点：1、容易繁殖，倍增时间18～24小时2、可高效表达外源基因。TN-5B1-4来源：粉纹夜蛾（Trichoplusiani，TN）卵细胞；特点：1、培养要求条件低，可用无血清培养基培养2、快速倍增，能适应悬浮培养。3、分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍。二生物反应器存在的主要问题主要论述植物作为反应器的主要问题2.1转基因沉默是指转基因在受体植物中往往不能稳定表达,有时甚至完全不表达,或者说利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。其可以通过以下途径解决:①探明影响植物基因表达的基因调控元件,加以修饰和开启控制;②了解转录过程,以便在转录水平进行基因操作,提高转录效率;③研究翻译过程,提高翻译效率;④构建一些新的植物高效表达系统,即各种载体及高效元件。2.2表达水平低大多数转基因植物通过自交后可以选择出目的基因纯合的后代,可以稳定遗传,使表型得以延续。但是大部分外源基因的表达水平在植物体内不高,目前没有得到很好的解决。可以尝试用如下方法加以解决:采用适当的强启动子、增强子序列和前导序列,使用偏爱密码子,将转基因产物定向到合适的细胞分隔(如细胞质、质外体、内质网腔、叶绿体液泡等),组织器官特异性表达(如种子、块茎、果实、橡胶树乳管等),去除mRNA不稳定序列,同时表达有助于产物正确折叠的酶或蛋白质(如分子伴侣)。此外,还可用植物病毒作为载体提高表达量。虽然这一问题可以解决,但要形成一套完整的外源基因在植物体内的高效表达体系还有待深入研究。2.3重组蛋白质中糖链结构的改变植物表达蛋白质的氨基酸序列和它的原始序列通常是相同的,并且在植物中能形成类似于人类等哺乳类动物的复杂型糖链结构,但是二者在高尔基体中的糖基化过程存在较大差异。植物中糖蛋白缺少唾液酸和半乳糖残基,特异存在α2(1,3)2岩藻糖和β2(1,2)2木糖。而唾液酸和半乳糖残基缺失会影响糖蛋白在人体内的稳定性及半衰期,使其活性降低;α2(1,3)2岩藻糖和β2(1,2)2木糖的存在则易引起人体内的免疫原性。为了避免植物高尔基体中特异的糖基化过程,人们发现在表达蛋白质的后面添加KDEL序列,可将蛋白质定位在内质网中,从而形成对人无免疫应答的高甘露糖型糖蛋白质,同时还可以提高蛋白质的表达量。2.4下游生产成本高尽管植物生产体系具有许多优点,但如果产物需提纯,其费用还是比较昂贵的,因此有待降低下游生产成本,尽可能地避免或部分避免表达产物的纯化,如用转基因植物生产直接口服疫苗。有时通过被修饰植物的直接消化运输生物药物产物可能不需要纯化,这种生物药物及可食用疫苗能以种子、块茎或果实的形式储存和分配,可以直接利用,这样就大大简化了下游的加工成本。另外,也可将植物种子油脂体作为蛋白或肽类的载体,外源基因以融合蛋白的形式表达,油脂蛋白具有亲脂性使其成为高效的多肽纯化系统。2.5转基因药品的安全性问题目前,虽然通过植物生物反应器生产外源蛋白相对于动物和微生物来讲安全性更高一些,但是转基因产品的安全性仍存在争议,如在口服药物和口服疫苗方面,植物是否含有对直接口服蛋白有影响的因子。公众对转基因产品的接受和认可程度还不够,从而使转基因产品的市场化进程受到影响。因此,一方面要加大宣传普及力度,另一方面还要对转基因产品的潜在危险性进行充分评价,开发清洁载体,防止目标产物受到污染,同时还要制定相应的安全和管理法规。展望尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决,但利用植物表达系统已成功地表达了多种具有生理活性的外源多肽,而且有些已经进行了人体和动物的试验,其前景是可观的,随着人类基因组计划研究的不断深入,会发现有更多医疗价值的蛋白质,因此利用转基因植物将会成为最具潜力的生产系统来生产这些药物,为人类健康做出巨大的贡献。三求职应有的知识储备1.掌握数学、物理、化学等方面的基本理论和基本知识；2.掌握基础生物学、生物化学、分子生物学、微生物学、基因工程、发酵工程及细胞工程等方面的基本理论、基本知识和基本实验技能，以及生物技术及其产品开发的基本原理和基本方法；3.了解相近专业的一般原理和知识；4.熟悉国家生物技术产业政策、知识产权及生物工程安全条例等有关政策和法规；5.了解生物技术的理论前沿、应用前景和最新发展动态，以及生物技术产业发展状况；6.掌握资料查询、文献检索及运用现代信息技术获取相关信息的基本方法；具