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二、名词解释（每题2分，共20分）1、Southernblotting:Southern印迹：Southern发明的一种影印转移物质的方法。2、Cosmidvector:黏粒载体：含有cos位点的质粒载体。3、cDNAlibrary:cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。4、RACE:是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。5、Probe:探针：指被标记物质标记了的核酸。6、RT-PCR：逆转录PCR：先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR。7、Insertinactivation:插入失活，基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点，在该位点用相应的限制性内切酶处理，并将外源DNA片段插入该位点，则插入的外源DNA片段将破坏原有基因的读码框，往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达，或即使翻译表达，形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质，这一现象称为插入失活。。8、S-DSequence:S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3，末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine、Dalgarno发现，故后来命名为Shine—Dalgarno序列，简称S-D序列。9、Shuttleplasmidvector:穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。10、MCS:指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。三、简答题（每题5分，共25分）1、理想质粒载体的必备条件？答：⑴具有较小的分子质量和较高的拷贝数。⑵具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。⑶具有两种以上的选择标记基因。⑷缺失mob基因。⑸插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。2、核酸操作的基本技术有哪些？答：①核酸提取与纯化②核酸的检测与保存③核酸的凝胶电泳④核酸分子杂交3、影响核酸保存的关键因素是什么？怎样保存核酸制品？答：关键因素：①保存液的酸碱度②保存温度保存方法：①一般保存可用浓盐液，NaCL-柠檬酸缓冲液或0.1mol/L醋酸缓冲液。②对DNA来说，在pH4～11的范围分子的碱基较稳定，超出此范围DNA易变性或降解，低温、稀碱下保存DNA及低温下保存RNA均较稳定。③固态核酸通常在0℃以上低温干燥保存即可。4、合成cDNA第二链的主要策略有哪些？答：①自身引导合成法②置换合成法③PCR合成法④快速扩增cDNA末端法⑤双链cDNA末端的处理⑥cDNA与载体的连接5、基因工程诞生的理论基础是什么？答：是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：①证实了DNA是遗传物质②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：①限制核酸内切酶的发现与DNA切割②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接③基因工程载体的研究与应用四、问答题（每题10分，共40分）1PCR技术主要应用在哪些领域？答：①核酸基础研究②序列分析③检测基因表达④从cDNA文库中放大特定序列⑤研究已知片段邻近基因或未知DNA片段⑥进化分析⑦医学应用⑧分析生物学证据⑨性别控制⑩转基因检测。2细菌的限制与修饰系统有什么意义？大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示的4种表型是什么？？答：宿主控制的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的作用，一是保护自身DNA不受限制；二是破坏入侵外源DNA使之降解。细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身DNA与外源DNA的。外源DNA可以通过多种方式进入某一生物体内，但是它必须被修饰成受体细胞的限制内切酶无法辩认的结构形式，才能在寄主细胞内得以生存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。大肠杆菌K12限制与修饰系统的遗传分析揭示，它有以下4种表型：rk+mk+野生型rk-mk+限制缺陷型rk-mk-限制和修饰缺陷型rk+mk-修饰缺陷型3试述5′RACE技术原理和方法。答：PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术（RACE）。如果已知mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly(A)尾（3′末端）或附加的同聚尾（5′末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得5′末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly(A)尾。通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。4大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍？答：特点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。存在的障碍：第一，在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及16S核糖体RNA3′末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。8、S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA3，末端碱基互补的序列，该序列最初由Shine、Dalgarno发现，故后来命名为Shine—Dalgarno序列，简称S-D序列。1、什么是包涵体？重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。2、什么是α-互补筛选？质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（lacZ），当外源DNA插入到它的lacZ，可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫α互补。3、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？⑴酶的纯度。⑵DNA样品的纯度。⑶DNA的甲基化程度。⑷酶切反应的温度与时间。⑸DNA分子的构型。⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。5、基因工程诞生的理论基础是什么？是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：①证实了DNA是遗传物质②揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：①限制核酸内切酶的发现与DNA切割②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接③基因工程载体的研究与应用四、问答题（每题10分，共40分）1如何有效地提高外源基因的表达效率？⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提高翻译水平：①调整SD序列与AUG间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③增加mRNA的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质2试述载体构建一般方法A目的基因分析（1）ORF分析（2）酶切位点分析B载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析C连接体系与连接时间确定4大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。一、名次解释（解释并翻译下列名词术语，每题4分，共20分）1．魔斑：2．转导与转染：3．RNA干扰：4.融合蛋白：5．考斯质粒：二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能（每题2分，共10分）1.核酶：2.DNA探针：3.Klenow酶：4.分子克隆：5.载体：三、分别说出5种以上RNA的功能？（10分）四、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？（10分）五、说明双脱氧链终止法（Sanger法）测定DNA一级结构的原理与方法？（10分）六、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（10分）七、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。（10分）八、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？（2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？（20分）载体：vector，能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。2．不相容性：incompatibility，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。3．cDNA基因文库：cDNAlibrary，是指以mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。4．环腺苷酸受体蛋白.：cAMPreceptorprotein，CRP，cAMP与CRP结合后所形成的复合物称激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）5．核酶：ribozyme，具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工过程中起到自我催化的作用。二、说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能（每题2分，共10分）1SD序列：是核糖体与mRNA结合序列，对翻译起到调控作用。.2.Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是从DNA聚合酶I全酶中去除了5’3’外切酶活性3.蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。4.互补干扰RNA：micRNA，或称反义RNA，与mRNA序列互补，可抑制mRNA的翻译。5.限制性内切核酸酶：常简称为限制酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的水解酶。三、典型的DNA重组实验通常包含几步？（10分）①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体），形成一个新的重组DNA分子。②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。③对那些吸收了重组DNA的受体细胞