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植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为超氧阴离子自由基（O2－）。O2－既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（1O2）等。·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。二、实验原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值换算成NO2－的浓度，再根据反应式（如下）：NH2OH+2O2－＋H＋→NO2－＋H2O2＋H2O可以直接进行O2－化学计量，从而算出样品中O2－含量。三、实验材料、仪器设备及试剂1.材料：新鲜小麦叶片。2.仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；吸耳球等。3.试剂配制：（1）65mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）（2）10mmol·L－1盐酸羟胺（3）17mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水=3：1配制）（4）7mmol·L－1α－萘胺（以冰醋酸：水=3：1配制）（5）亚硝酸钠标准液：称NaNO2（AR级）0.1000g，蒸馏水定容至100mL，摇匀，取5mL用蒸馏水定容到1000mL，即为每毫升含NO2－5μg的标准液。四、实验步骤1.提取液制备称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5ml,研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，上清液即为样品提取液。2.亚硝酸根标准曲线的制作（1）取7支试管，编1～7号，按照下表的顺序添加试剂，每加一种试剂后都要摇动使之混匀。表NO2－标准曲线测定反应体系试剂（ml）试管编号1234567NO2－5μg的标准液00.10.20.40.60.81.0蒸馏水21.91.81.61.41.21.0对氨基苯磺酸4444444α－萘胺0.40.40.40.40.40.40.4每管NO2－μg数0204080120160200试剂加完后将各试管置于30℃恒温水浴中保温30min，显色反应后测定A530。（2）标准曲线绘制以1～7号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，A530吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。3.O2－含量测定取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复）（1）NO2－的产生试剂ml/试管编号123O2－提取液2.02.02.0PBS缓冲液1.51.51.5盐酸羟胺0.50.50.525℃，保温20min（2）NO2－的显色（同标准曲线）试剂ml/试管编号123上述反应液2.02.02.0对氨基苯磺酸α－萘胺30℃，保温30min显色反应后，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。4.O2－含量计算的方法根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，并换算成O2－的浓度（X），并按照下式计算O2－的含量：O2－含量（μg/gFW）=2X×Vt×n/（FW×Vs）式中，Vt——为样品提取液的体积（mL）；n——为测定时样品提取液的稀释倍数；FW——样品鲜重（g）；Vs——显色取样品液的体积（mL）；X——为从标准曲线上查得样品液NO2－浓度。五、实验结果（1）标准曲线的绘制结果：试管编号1234567每管NO2－μg数0204080120160200A5300.0000.1060.2390.4350.6190.8341.007标准曲线绘制结果如下：（2）O2－含量计算根据公式计算得到以下结果：O2－含量（μg/gFW）=2X×Vt×n/（FW×Vs）式中，Vt——为样品提取液的体积（mL）；n——为测定时样品提取液的稀释倍数；FW——样品鲜重（g）；Vs——显色取样品液的体积（mL）；X——为从标准曲线上查得样品液NO2－浓度。取样编号123鲜量（g）0.9981.0251.018A5300.1420.1490.153标曲上查得样品液NO2－浓度（X）27.327.529.4O2－含量（μg/gFW）54.753.7557.7