基因工程-第3章-核酸操作的基本技术

第三章核酸操作的基本技术3.1碱抽提法提取DNA碱变性抽提法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA的方法，是当今分子生物学研究中的常规方法。碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值达到12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节其Ph至中性时，变性的质粒ＤＮＡ又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体ＤＮＡ不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体ＤＮＡ与不稳定的大分子ＲＮＡ、蛋白质－ＳＤＳ复合物等一起沉淀下来而被除去。碱变性抽提质粒ＤＮＡ，除了菌体培养、质粒扩增和收集菌体外，其提取过程大体分为三个步骤：（１）从染色体ＤＮＡ中分离质粒ＤＮＡ。（２）去除质粒ＤＮＡ中的ＲＮＡ。（３）进一步纯化质粒ＤＮＡ，去除蛋白质等杂质。3.1.1碱抽提法所用各类试剂的生化作用（１）溶菌液中的溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的Ｂ－１，４糖苷键，因而具有溶菌作用。（２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９的溶液中是稳定的，但当pH１２或pH３时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。ＳＤＳ是离子型表面活性剂，它可以溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中的核蛋白，还能与蛋白质结合成为Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是ＳＤＳ能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止它影响Raase的活性。（３）ＮaＡc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。目的是把pH12.6的抽提液调节至中性，使变性的质粒ＤＮＡ能够复性，并能稳定存在。而高盐的３mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、以及ＳＤＳ－蛋白复合物的凝聚而沉淀之。（４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去ＤＮＡ周围的水分子，ＤＮＡ失水而易于聚合。一般实验中，是加２倍体积的无水乙醇与ＤＮＡ相聚合，其乙醇的最终含量占６７％左右。（５）ＴＥ缓冲液：在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑ＤＮＡ的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。采用Tris-HCL的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存ＤＮＡ时，大都采用Tris-HCL系统，而ＴＥ缓冲液中的ＥＤＴＡ更能稳定ＤＮＡ的活性。（６）酚－氯仿：酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的ＤＮＡ分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。（７）异戊醇：在抽提ＤＮＡ时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止分子相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中泡沫的产生。一般采用氯仿与异戊醇之比为２４：１。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为２５：２４：１。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。（８）饱和酚：因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提ＤＮＡ过程中，不致吸收样品中含有ＤＮＡ的水分，减少ＤＮＡ的损失。用Ｔris调节pH为８是因为ＤＮＡ在此条件下比较稳定。质粒DNA的小规模提取－碱裂解法1）接种一单菌落于3ml含70μl/mlAmp的LB液体培养基中。200转/分37℃振荡培养过夜（约8－10h）。12000rpm离心1min收集细菌。2）用STE重悬细菌沉淀，12000rpm离心5min，弃上清。3）将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液I中，加入200μl新配制的溶液II，温和转动使之混匀，冰浴2min。4）加入150μl溶液III，将管倒置摇荡1min，冰浴5min。质粒DNA提取溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），高压灭菌，4℃保存。质粒DNA提取溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS，现配现用。质粒DNA提取溶液Ⅲ：5M乙酸钾溶液60ml，冰乙酸11.5ml，灭菌水28.5ml。5）12000rpm离心8min，小心取上清于离心管中。加等体积酚：氯仿抽提一次。6）取上清液加入1/5体积5M的乙酸胺，再加入2倍体积无水乙醇，12000rpm离心5min，弃上清，加入70％乙醇沉淀。7）离心弃上清，真空抽干，去除痕量乙醇。8）加入50μlTE并加入1μlRNase放入37℃水浴1h。9）0.7%琼脂糖电泳检测其含量。3.1.2碱抽提法抽提DNA过程中应注意的问题（1）染色体DNA、蛋白质与RNA是否去除干净，是否获得一定得率的质粒DNA。（2）所用器皿必须严格清洗，各种试剂配制是否准确，有的需高压高温灭菌。（3）加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖摇动4-5次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放入冰箱中沉淀DNA。3.2DNA提取的其他方法2.2.1质粒DNA的分离纯化2.2.1.1微量提取质粒ＤＮＡ小规模制备质粒ＤＮＡ的特点是可以一次制备多种质粒ＤＮＡ，速度快、省时间、步骤简化、ＤＮＡ纯度好，可以用于酶切、连接，甚至多纯化几次还可作双链ＤＮＡ序列分析的模板等常规基因工程操作之用。主要有下列方法：有煮沸法、９６孔微量滴定板法、碱变性ＳＤＳ和和ＳＥＴ法、单链质粒ＤＮＡ的小量制备法、不需要苯酚抽提的质粒ＤＮＡ的小量制备和用商品化试剂盒制备质粒ＤＮＡ等。3.2.1质粒ＤＮＡ的大量制备在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒ＤＮＡ，为此需要大量提取质粒ＤＮＡ。大量提取的质粒ＤＮＡ一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。ＤＮＡ的抽提方法主要有：煮沸裂解法、ＳＤＳ裂解法、Triton裂解法和Wizard大量ＤＮＡ纯化系统等。质粒DNA的大量制备1）接种含有目的片段的单菌落于100ml液体LB培养基中，37℃培养过夜。4000rpm，4℃离心10min，收集菌体。2）将细菌沉淀用20ml冰预冷的STE溶液重悬，按上述方法重新离心，去上清，倒置，用吸水纸吸干残留液，加入冰预冷溶液Ⅰ2ml，将细菌沉淀重悬。3）加200μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mMTris·Cl，pH8.0)，混匀。4）加入4ml新配制的溶液Ⅱ，缓慢颠倒数次，充分混匀内容物，于室温放置5-10min。5）加2ml用冰预冷的溶液Ⅲ，将离心管颠倒数次，冰浴15min。12000rpm，4℃离心20min。6）将上清转移至另一离心管中，加0.6倍体积异丙醇，充分混匀，于室温放置10min。10000rpm，室温离心15min，回收质粒沉淀。7）去除上清，用70%乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1mlTE中。8）加入5μlRNaseA（5mg/ml），37℃消化1hr。9）转移至小离心管，用等体积的苯酚，苯酚∶氯仿，氯仿，各抽提一次。10）加入1/5体积的10MNH4AC，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置30min。12000rpm，室温离心10min。11）弃上清，70%乙醇洗沉淀两次，真空抽干，溶于适量TE中，储存于-20℃。3.2.2质粒ＤＮＡ的纯化１、聚乙二醇沉淀法纯化质粒ＤＮＡ２、氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环ＤＮＡ３、从质粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ（１）通过１mol/LNaCl进行离心（２）通过Bio-GelA-150m或SepharoseCL-4B进行层析3.2.3基因组或其他ＤＮＡ的抽提2.2.2.1细菌基因组ＤＮＡ的制备以微量制备法为例：１、５ml细菌培养液生长至对数生长期。取1.5ml转入小离心管中离心２min.2、用567ulＴＥ缓冲液重新悬浮沉淀，加入30ul的１０％的ＳＤＳ和3ul的20mg/ml蛋白酶Ｋ，混合。在３７℃下保温１h。３、加入100ul的５mol/LNaCl，完全混合，再加入80ulCTAB-NaCl溶液，混合。在65℃下保温10min。(CTAB,十六烷基三甲基溴化铵)４、加入等体积的酚－氯仿－异戊醇，混合。离心４－５min，将上清液转移至一新的离心管中。５、按上述步骤重复抽提。将上清液转移至一新的离心管中。６、加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直至ＤＮＡ沉淀。用70%乙醇洗一下沉淀。离心５min，弃去上清液后真空干燥。用100ulＴＥ缓冲液重新悬浮ＤＮＡ。3.2.4哺乳动物细胞基因组ＤＮＡ的抽提哺乳动物基因组DNA通常先用SDS等裂解,再用苯酚抽提进行分离。用这类方法产生的DNA长度（100-150kb）适用于Southern分析和用λ噬菌体构建基因组文库。1、哺乳动物组织细胞的DNA提取组织样保存在70%乙醇中，－20℃冻存。提取ＤＮＡ时组织样需研碎，乙醇挥发掉，提取方法同质粒的ＤＮＡ提取法。2、哺乳动物血液基因组DNA的提取（1）取750ul冻存血加入等量PBS，混合均匀（2）12000rpm离心5分钟，弃上清（3）加入450ulDNA提取buffer,重悬沉淀（4）加入Rnase至终浓度20ug/ml，37℃温育1小时(5)加入蛋白酶K至终浓度100ug/ml,混匀，55℃水浴消化过夜(6)加入等体积Ｔris饱合酚，温和摇动10分钟，12000rpm离心５分钟(7)将上层水相转移至另一干净离心管(8)再加入等体积酚：氯仿和氯仿，各抽提一次(9)上层水相用1/5体积乙酸钠和２倍体积无水乙醇沉淀ＤＮＡ(10)12000rpm离心10分钟，收集沉淀，70％乙醇洗沉淀(11)真空抽干，用适量TE（pH8.0）溶解ＤＮＡ2.2.5从植物中分离基因组DNA从植物中分离高产量和高质量DNA不是一件容易的事。由于细胞壁及植物特有的细胞内物质，需要用较特殊的处理方法。1、用CTAB抽提植物DNA（1）将组织放入离心管中，加入5倍体积的抽提缓冲液，再加入一些洗过的灭菌海沙于-20℃冷冻。（2）用杵将组织压软，置组织于液氮中磨碎。（3）短暂振荡，于65℃温浴5min。（4）加1倍体积的氯仿-异戊醇混合物，轻轻颠倒几次使之混匀。离心5min,将上层水相转移到另一管中。（5）加1倍体积的溴化乙锭液，1倍体积苯酚和1倍体积氯仿，轻轻混匀。离心取上清。溴化乙锭可帮助除去多糖。大多数植物组织可省去这一步。（6）加1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积异丙醇，于-20℃放置30min或过夜，沉淀DNA。（7）以12000r/min离心10min，倒掉上清。（8）加0.5ml冷的70%乙醇，重悬沉淀，离心2min。（9）真空或37℃放置10min，干燥DNA。（10）适量TE溶解DNA。3.3DNA的定量和纯度测定对于基因操作中的载体DNA和外源目的DNA片段，必须对其浓度、纯度、构型、相对分子量大小等基本情况进行了解。有时DNA中含有酚类和多糖类物质会影响酶切和PCR的效果，尤其DNA浓度是一个非常关键的因素。3.3.1紫外光谱分析法紫外光谱分析法的原理基于DNA（RNA）分子在260nm处有特异的紫外吸收峰且吸收强度与系统中DNA或RNA的浓度成正比。该法的特点是准确、简便，但所需仪器较昂贵。由于测定OD260时，难以排除RNA、染色体DNA、以及解链的增色效应的因素，因此测得的数据往往比实际浓度偏高。衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值。OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于1.8则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质的污染。在260nm的读数用于计算样品中核酸的浓度,OD值为1相当于大约50ug/ml双链DNA