基因工程甜蛋白

基因工程甜蛋白人工设计并合成了monellin甜蛋白基因，并在大肠杆菌中表达，经测定其甜度是相同重量蔗糖的1100倍，且甜味纯正。经诱导表达，分离纯化得到的[Asn66]monellin甜蛋白，其甜度是相同重量蔗糖的4500倍。为提高甜蛋白的表达效率，研究了培养基、菌龄等8种因素对甜蛋白表达的影响，确定了发酵条件的优化方案，使甜蛋白的产量由原来的70μg/ml提高到了240μg/ml，表达效率占菌体可溶性蛋白由25%提高到40%。该项目2000年通过了专家鉴定，为甜蛋白monellin的规模开发和应用提供了优良的基因工程菌株和发酵工艺数据。其关键技术“编码甜蛋白的合成DNA序列及生产该蛋白质的方法”和“编码高甜度莫奈灵的基因及其产物蛋白的利用”于2001年1月获国家发明专利2项（专利号分别为ZL95117885.7和ZL98102420.3）。有关技术已转让给山西省大同市同风肉制品厂，甜蛋白进入中试。转基因抗青枯病马铃薯设计合成了新抗菌肽基因，构建了一批单价及双价抗菌肽基因的植物表达载体，并导入马铃薯，获得218个转基因马铃薯株系，其中185个株系中有抗菌肽基因的表达。在温室及田间人工病圃对转基因马铃薯进行青枯病抗性鉴定，获得中抗水平的株系8个，抗性比起始品种提高1～2级。在四川省对34个转基因马铃薯株系进行农艺性状筛选，有些株系已接近起始品种米拉。完成了转基因马铃薯田间释放的安全性评价工作，农业部已经批准转基因抗青枯病马铃薯在四川省进行环境释放，抗病株系累计试种约120亩。“马铃薯抗菌肽基因工程技术体系的建立及抗青枯病新株系的获得”项目成果在继1996年获农业部科技进步一等奖后，1997年又获国家技术发明三等奖。“抗菌肽及其生产方法和应用”乳糖酶基因的克隆、高效表达及其在乳品工业上的应用筛选到一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspergilluscnadidus),将其乳糖酶基因克隆并通过测序，得到该基因的基因组DNA和cDNA序列。在毕赤酵母中高效表达乳糖酶基因，在5L发酵罐水平乳糖酶的表达量可达6g/L,酶活为3600U/mL。将该乳糖酶纯化，与商业化应用的来源于A.oryzae的乳糖酶进行了酶学性质的比较。结果表明，该乳糖酶在比活、金属离子稳定性、热稳定性、Km等方面均优于A.oryzae的乳糖酶，是一个更具有生产应用前景的新基因。乳糖酶水解实验表明在不同的温度区间，该酶均能有效地水解牛奶中的乳糖。该成果已通过专家鉴定。“乳糖酶基因的克隆、高效表达及其在乳品工业上的应用”草甘膦极端污染环境微生物资源利用从极端污染环境中分离了草甘膦高度耐受和高水平降解菌株30余株，克隆了新型草甘膦抗性EPSPS编码基因3个，具有如下特性：1）草甘膦抗性表现突出，比已见报道的EPSPS基因都高；2）结构新颖，在核酸水平上与已知的EPSP合成酶基因没有任何同源性，新基因中没有出现受专利保护的任何EPSPS抗草甘膦氨基酸保守序列；3）功能明确，可以对大肠杆菌EPSPS编码基因突变株进行功能互补，具有完整的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性。新型EPSP合成酶基因的高抗草甘膦特性在模式植物烟草中得到验证，转基因烟草在高于田间工作浓度3倍的5%草甘膦铵盐水剂下能正常生长。新型高抗草甘膦基因的获得打破了跨国公司的技术垄断，突破了我国抗草甘膦转基因作物产业化的技术瓶颈。目前，采用上述新型高抗草苷膦基因进行转基因棉花和油菜的工作也在进行之中。转植酸酶基因玉米的研制饲料中玉米的用量高达50%以上，我国玉米产量的60%用于饲料加工。第一代植酸酶产品以微生物发酵为基础用作饲料添加剂。该项研究工作进一步利用种子生物反应器生产第二代植酸酶产品直接用于饲料加工。将具有自主知识产权的植酸酶基因转化玉米，经过六代选育，得到了表达植酸酶活性达到1000~40，000单位/公斤种子的转基因玉米纯合系，并稳定遗传。转基因玉米动物饲喂的实验结果，证明转植酸酶基因玉米可以替代微生物发酵生产的植酸酶添加剂，满足饲料加工标准的要求。转基因玉米进入环境释放安全评价阶段并申请了国家发明专利（专利号：ZL03137476.X），为“营养型、环保型、节约型、专用型”的转植酸酶基因玉米品种的培育和应用奠定了基础。有机磷农药消解酶酶制剂的研制构建了高效稳定表达有机磷消解酶的重组毕赤酵母；在小试水平上确立利用基因工程酵母菌生产有机磷农药消解酶的稳定的发酵工艺并对得到的重组毕赤酵母进行了遗传及表达稳定性研究；筛选到一株产有机磷消解酶的新菌株，经国家微生物菌种保藏中心鉴定为假产碱假单胞菌。对其分泌的有机磷消解酶蛋白进行了分离纯化，并对其酶学性质进行了研究。检测表明OPHC2是一种新的有机磷农药降解酶。此基因已被GenBank收录。已通过中间试验安全性评估。技术列表乳糖酶基因的克隆、高效表达及其在乳品工业上的应用编码向日葵γ生育酚甲基转移酶的DNA序列和氨基酸序列及其应用同时具有两种不同杀虫机理的杀虫融合基因及其应用一个玉米bZIP类转录因子及其编码基因与应用对有机磷农药具有广谱降解能力的菌株及其筛选方法光诱导表达GACAB启动子及不同区段的表达功能编码海岛棉防卫反应基因的核苷酸序列、含有该序利用衣藻叶绿体基因工程生产新型口蹄疫苗的方法利用植物叶绿体生产口服动物口蹄疫苗的方法运动发酵单胞菌工程菌及其应用运动发酵单胞菌乙醇发酵基因的克隆及应用高抗草甘膦的EPSP合成酶及其编码序列胆固醇氧化酶基因及其应用棉花Nodulin-like基因及其启动子棉花ADP-ribosylation factor 1(arf 1)基因及其启动子用毕赤酵母分泌表达高甜度莫奈灵适用于高密度发酵的毕赤酵母新菌株提高轮状病毒VP7或VP4蛋白在植物中表达含量的方法及产品一种新的有机磷农药降解酶及其编码基因一种调控赤霉素生成的转录因子及其编码基因与应用一种利用转基因植物生产植酸酶的方法玉米BZIPLANT转录因子及其编码基因与应用一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器可变盐单胞菌高抗草甘膦的EPSP合酶及其编码序列苯胺双加氧酶基因及其应用调控蛋白TSRF1在植物抗病中的应用运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶基因突变的工程菌及其构建和用途种高效固氮工程菌及其构建和用途固氮负调节基因突变的泌铵工程菌的构建及应用一种扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法高甜度莫奈灵DNA序列及高效表达所述DNA序列的方法编码甜蛋白的合成DNA序列及生产该蛋白质的方法编码杀虫蛋白质融合基因和表达载体及其应用植酸酶及其基因的克隆和表达抗菌肽及其生产方法和应用合成编码雪花莲凝集素的抗同翅目害虫基因及其应用两种编码杀虫蛋白质基因和双价融合表达载体及其应用贾士荣:葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用贾士荣:胞内或胞外协同表达两种抗真菌病基因培育抗病作物林敏：固氮斯氏假单胞菌及其菌膜的培养方法林敏：遗传工程固氮粪产碱菌与固氮巨大芽孢杆菌共培养发酵工艺转基因抗青枯病马铃薯转基因抗虫马铃薯基因工程甜蛋白乳糖酶基因的克隆、高效表达及其在乳品工草甘膦极端污染环境微生物资源利用转植酸酶基因玉米的研制转基因抗虫棉BTCry1Ac/Ab胶体有机磷农药消解酶酶制剂的研制转基因抗虫水稻基因工程甜蛋白Monellin转Cry3Aa7和Cry1Ba3双价基因抗虫马铃薯和工程菌的研制乳糖酶基因的克隆、高效表达及其在乳品工业上的应用转抗虫基因三系杂交棉分子育种技术体系利用油菜油体表达体系生产鲑鱼降钙素利用玉米种子生物反应器生产高活性植酸酶