基因工程第二章1Jun

第二章基因工程中常用的工具酶基因工程的基本流程TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS:RESTRICTIONENZYMESGLUE:DNALIGASEVEHICLE:PLASMIDORVIRALVECTORS第二章基因工程中常用的工具酶第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接第三节其他工具酶一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割一、限制性内切酶的发现和细菌的限制—修饰作用1、细菌的限制和修饰系统的发现•1950年代初期，两组科学家几乎同时发现了限制修饰现象，当时称为宿主专一性:1952年，Luria,Humann等：T偶数噬菌体,1953年，Bertani,Weigle等：λ和P2噬菌体。•大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主限制和修饰现象更具普遍性和代表性。E.coli-λ噬菌体的限制修饰模式•噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。•仍有少量λ(K)可在E.coliB中生存，是因E.coliB对λ(K)进行了修饰。1959年，瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源DNA,修饰酶保护自身DNA2.细菌的限制—修饰理论的提出侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，细菌通过这种方式进行自我保护。细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，①Dam甲基化酶--在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。②Dcm甲基化酶--在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。2.细菌的限制—修饰理论细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。•WernerArber于1962-1968年发现限制与修饰体系，1968年分离得到I型限制酶EcoB.•1970年，H.Smith首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到II型限制酶HindⅡ.•1971年，D.Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40的限制酶谱。Arber,Smith和Nathans获得了1978年Nobel生理学和医学奖。3.限制性核酸内切酶的发现•到1986年下半年，发现615种限制酶和98种甲基化酶。•到2006年2月，共发现4583种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3773种，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有68、3692、10种。3.限制性核酸内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割•限制性内切酶系统中有两个部分组成：1.核酸酶2.甲基化酶•来源：细菌染色体、噬菌体/病毒•限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、转导或转染而传给其他个体二、限制性核酸内切酶的定义•限制性内切酶是一组可以特异性地识别DNA上的某一特定序列，并将之水解的核酸酶。限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。限制酶裂解DNA双链的磷酸二酯键酶切得到5`-P和3`-OH一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割三、限制性核酸内切酶的命名①第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。②第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。③如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前3个字母紧紧排在一起。HindⅢ：Haemophilusinfluensaed④当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时，需要在名称中标出遗传成分。EcoRI：EscherichiacoliR⑤若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马数字表示。SacI(II)：StreptomycesachromagenesI(Ⅱ)一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割性质酶Ⅰ酶Ⅱ酶Ⅲ结构与功能三亚基多功能酶单一功能的酶同型二聚体二亚基双功能的酶限制与修饰酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制作用的辅助因子ATP,Mg2+,SAM（S-腺苷甲硫氨酸）Mg2+ATP,Mg2+,SAM寄主特异性位点序列特异性,非对称序列特异性,旋转对称序列特异性,非对称序列切割位点在距寄主特异性位点至少1kb的地方位于寄主特异性位点或其附近在距寄主特异性位点3´端24~26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割甲基化作用位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在DNA克隆中的用途无十分有用有用四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类五、II型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途第一节限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割五、II型限制性核酸内切酶的基本特性•是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。•II型限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如PvuII(157个氨基酸)，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。•根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类：A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况：a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC)d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)1、根据酶作用特点进行的分类五、II型限制性核酸内切酶的基本特性B.IIS型酶•另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。C.第三种II型限制性内切酶•第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。•这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。a.识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性b.极为稳定c.辅酶:Mg2+2、II型限制性内切酶的特点五、II型限制性核酸内切酶的基本特性（1）限制酶识别序列的长度限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列被称为识别序列。识别序列的长度一般为4～8个碱基，最常见的为6个碱基。切割频率理论上为1/4n（n为识别序列长度），实际上与序列有关。3、识别序列MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起五、II型限制性核酸内切酶的基本特性（3）限制酶识别序列的结构►限制酶识别序列大多具有回文对称结构EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’►有些限制酶的识别序列不对称AccBSⅠCCG↓CTCGGC↑GAG（2）富含GCⅡ型酶识别回文序列►有些限制酶可识别多种序列►有些限制酶识别的序列呈间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。AlwNⅠCAGNNNCTGGTCNNNGACAccⅠGTMKACCAKMTGM=A、CK=G、T（4）限制酶切割的位置限制酶对DNA的切割位置大多数在识别序列内部，但也有在外部的。（5）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ4．末端种类(切割方式)（1）5’-黏性末端和3’-黏性末端（cohesiveend）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。（2）平末端（Bluntend）在回文对称轴上同时切割DNA的两条链，则产生平末端。如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）五、II型限制性核酸内切酶的基本特性粘性末端的意义连接方便不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。5’末端标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。3’末端标记凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。粘性末端的意义部分常用的限制性内切酶（3）非互补黏性末端(不对称末端)当识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物的末端是不同的。BbvCⅠCCTCAGCGGAGTCGCCTCAGCGGAGTCG能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG(1).识别不同，切割不同eg:BamHIEcoRI-GGATCC--AGATCT--CCTAGG--TCTAGA-(2).识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)eg:BamHIBg1Ⅱ-AGATCT-GGATCC-TCTAGA-CCTAGG5.识别位点与切割方式之间的关系五、II型限制性核酸内切酶的基本特性(3).识别相同，切割不同eg:SmaIXmaI-CCCGGG--CCCGG-GGGCCC--GGGCCC-(4)．识别相同，切割相同──同工酶同裂酶eg:HpaⅡMspⅠ-CCGG--C*CGG--GGCC--GGCC-同裂酶（isoschizomers）概念用途有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究DNA甲基化作用。KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG有一些来源不同的限制性酶识别的是相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。用途如：限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一对同裂酶，共同的靶序列是CCGG。当其靶序列中含有一个5-甲基胞嘧啶（CCGG，*号表示甲基化的碱基），HpaⅡ不能够切割它，而MspⅠ对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C残基甲基化与否都能够切割之。*现已研究发现，许多动物DNA中90%以上的甲基，都是在序列CG处以5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较HpaⅡ和MspⅠ的DNA消化产物就可以检测出甲基化的存在。同尾酶（isocaudamer