上海交通大学附属新华医院--王连升博士-蛋白电泳在临床中的应用

临床蛋白电泳应用与解析王连升博士2013-12-19主要内容•血清蛋白电泳•免疫固定电泳•尿蛋白电泳•脑脊液蛋白电泳琼脂糖凝胶电泳原理-+蛋白加样位置阴极阳极0------+--------------电场作用力正常血清蛋白电泳图谱α-2巨球蛋白GammaBetaAlpha-2免疫球蛋白C3补体α-1抗胰蛋白酶结合珠蛋白转铁蛋白白蛋白α-1酸性糖蛋白血红素结合蛋白-+临床疾病的识别炎症肝病肾病……“M”蛋白的筛查及定量对疑似骨髓瘤患者检测单克隆免疫球蛋白早期检出无症状的骨髓瘤患者对骨髓瘤疾病进行随访及疗效观察血清蛋白电泳的临床应用免疫球蛋白C3补体α-1抗胰蛋白酶结合珠蛋白转铁蛋白白蛋白α-1酸性糖蛋白α-2巨球蛋白血红素结合蛋白急性期反应蛋白电泳图谱---急性炎症PN电泳图谱---慢性炎症免疫球蛋白C3补体α-1抗胰蛋白酶结合珠蛋白转铁蛋白白蛋白α-1酸性糖蛋白α-2巨球蛋白血红素结合蛋白电泳图谱---肝脏肝脏是血清蛋白合成的主要器官免疫球蛋白C3补体α-1抗胰蛋白酶结合珠蛋白转铁蛋白白蛋白α-1酸性糖蛋白α-2巨球蛋白血红素结合蛋白电泳图谱---肝病NP电泳图谱---肝硬化Beta-Gamma桥beta区：多克隆IgA↑gamma区：多克隆IgG↑电泳图谱---肾病肾小球滤过屏障损伤→白蛋白流失•低白蛋白•高α-2贾晓辉,马彧旻.齐齐哈尔医学院学报.2009,30(16):2015Alpha-2巨球蛋白NP总蛋白浓度降低(低于60g/l)电泳图谱---肾病综合征原因:免疫缺陷病、免疫抑制剂、游离轻链病电泳图谱---低免疫球蛋白NP电泳图谱---高免疫球蛋白原因:慢性感染、自身免疫病、慢性肝病、慢性肉芽肿NP血清蛋白电泳图谱常见类型图谱类型总蛋白Albα1α2βγ低蛋白血症↓↓↓↓N↑N↓N↑急性炎症/急性时相反应N↓N↑↑/N慢性炎症型↓↑↑↑弥漫性肝损害↓N↓↓↑↓↑肝硬化↓N↑↓↓N↓N↓β-γ↑桥肾病↓↓↓↓↑↑↑不定弥漫宽γ球蛋白血症型↑↓N↑↑M蛋白血症型在α2-γ区出现异常峰高α2（β）球蛋白血症↓↑↑↑妊娠（高α型）↓N↓↑↑N蛋白质缺陷个别区带出现特征性缺乏多克隆Igs单克隆Ig---“M”蛋白正常异常什么是M蛋白•单克隆浆细胞恶性增殖产生的均一蛋白•“M”–MultipleMyeloma多发性骨髓瘤–Macroglobulinemia巨球蛋白血症–Malignantlymphoma恶性淋巴瘤–MonoclonalGammapathies单克隆丙种球蛋白病•电泳曲线：异常峰恶性浆细胞增殖仅次于白血病（血液肿瘤）发病率•占所有肿瘤的1~2%，血液肿瘤的10%•美国：白人4/10万；黑人10/10万•欧洲：2.5~3.0/10万•亚洲：1~2/10万•中国：无确切数据发病年龄•老年病，随年龄↑发病率↑•欧美：高峰65~70岁，中位年龄68岁•中国：高峰55~65岁，中位年龄57岁男女比例男：女=3:2多发性骨髓瘤(MultipleMyelomaMM)临床特征缺乏特异性临床表现骨痛、病理性骨折：最常见肾功能受损、肾衰贫血血钙水平异常免疫功能失调，感染心、脑脏器微循环障碍，心脑血管病变多学科骨科、感染科、呼吸科、内分泌肾内科、泌尿科、心内科、神经科、消化科多发性骨髓瘤临床表现/并发症多发性骨髓瘤病人溶骨报告多发性骨髓瘤临床表现/并发症CalciumRenalAnemiaBoneCRAB多发性骨髓瘤现状晚骨折预后差增加负担感染发生率高肾脏病变不可逆死亡率↑↑就诊晚2/3确诊时已达中晚期误诊率高1/3非血液科首诊60%1557例多发性骨髓瘤误诊分析62024424411856291223309骨科肾内科血液科感染科心内科消化科内分泌神经内科其它误诊率：65.17%重视实验诊断39.8%15.6%19.8%7.6%15.6%实例-1患者信息性别：女年龄：69首次就诊科室：骨科诊断：多发性骨髓瘤实例-2患者信息性别：女年龄：69科室：消化内科诊断：慢性胃炎实例-3患者信息性别：女年龄：73科室：中医科诊断：贫血？多发性骨髓瘤及瘤前病变M蛋白骨髓克隆性浆细胞/浆细胞瘤ROTI有症状MM√≥10%√无症状MM(冒烟型,SMM)√≥10%瘤前病变意义未明M蛋病MGUS√10%早发现、早诊断、早治疗早发现、早诊断、早治疗肿瘤M蛋白筛查是关键正常血清单克隆Ig单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的检测•血清蛋白电泳是检测M蛋白的唯一方法若在区出现常的峰，且高宽比大于2:1,可以初步判定为M蛋白峰徐玲令,杨再兴,赵文静,屠小卿,高春芳,孔宪涛.第二军医大学学报.2004,25(12):1343-45单克隆免疫球蛋白(M蛋白)的检测单克隆M蛋白的电泳位置M蛋白阳性患者2007例的体液免疫特征分析国际骨髓瘤基金会2013推荐的M蛋白早期筛查流程M蛋白？什么类型？为什么要做免疫固定电泳血清免疫固定电泳ELP泳道:固定液G泳道：抗IgG重链抗血清A泳道：抗IgA重链抗血清M泳道：抗IgM重链抗血清K泳道：抗轻链抗血清L泳道：抗轻链抗血清仪器：Sebia琼脂糖凝胶电泳仪试剂：免疫固定电泳试剂灵敏度：125mg/L正常血清确认IgM型M蛋白血清蛋白免疫固定电泳应用举例（1）IF在区发现疑似M蛋白确认IgM+IgM型双克隆M蛋白在区发现疑似双克隆M蛋白IF血清蛋白免疫固定电泳应用举例（2）IgGLambda型M蛋白单克隆M蛋白出现在Alpha2-Beta区带血清蛋白免疫固定电泳应用举例（3）*纤维蛋白原，严格避免血浆标本血清蛋白免疫固定电泳应用举例（4）寡克隆免疫球蛋白电泳图谱多条(2)窄的条带，通常比较微弱。由于个别免疫球蛋白克隆增生。IgG型寡克隆电泳图谱IF血清蛋白免疫固定电泳应用特殊情况寡克隆条带在以下情况时常会出现:•骨髓或者器官移植治疗引起的免疫缺陷•风湿性关节炎•干燥综合症•红斑狼疮*自体免疫疾病•病毒:HIV,病毒性肝炎,EBV,CMV…•细菌和寄生虫感染:脑膜炎,脑炎…*感染引起的免疫缺陷何时进行免疫固定电泳检测血清蛋白电泳出现M蛋白原因不明的丙种球蛋白偏低患者有高骨髓瘤风险(老年、性别、病史、骨痛)血清电泳结果正常，但患者有骨髓瘤、轻链沉淀病、淀粉样病变等疾病临床症状轻链病血清蛋白免疫固定电泳特殊病例免疫固定结果显示为单独的成分血清：游离轻链尿液：本周氏蛋白本周氏蛋白•1844年HenryBenceJones在一个骨髓瘤患者尿中发现•一种具有特殊凝溶性质的蛋白–40－60℃发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀–轻链二聚体•大多数骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白浆细胞增生症影响血液中出现游离轻链尿液中出现起因结果骨髓瘤巨球蛋白血症CLL慢性白血病MGUS.....肾小管损伤淀粉样病变轻链沉淀病本周氏蛋白正常免疫球蛋白的合成浆细胞一条重链一条轻链组合一分子免疫球蛋白过剩轻链异常免疫球蛋白的合成恶变的浆细胞一种重链一种轻链组合单克隆免疫球蛋白大量过剩轻链肾毒性、异常沉积本周氏蛋白阳性患者•多表现为肾脏损害•极易误诊为慢性肾炎•轻链有3种形式出现在血清或尿中–正常的轻链过剩•慢性肝病、红斑狼疮等多克隆增殖性疾病–伴随轻链–单一轻链90~100℃40~60℃室温本周氏蛋白检测方法—热沉淀反应法本周氏蛋白检测方法---尿液的免疫固定电泳重链参考泳道复合轻链游离轻链本周氏蛋白检测结果解析游离lamda复合kappa游离lamda本周氏蛋白电泳的临床意义•浆细胞病的诊断和治疗监测–某些情况下，特别是对轻链型的M蛋白，比血清免疫固定电泳更加敏感–因为游离轻链的分子量比较小（25－50KDa）更容易通过肾脏清除进入尿液中，从而在尿中被检测到•病人甲，女，29岁，蛋白尿肾内科就诊。•SDS尿蛋白电泳：100％肾小球性蛋白•尿总轻链定量：κ5.95mg/dl(0－5.10)λ70.10mg/dl（0-5.0）；•血清蛋白电泳和免疫固定电泳未见单克隆蛋白临床病例血清免疫固定电泳（阴性）临床病例尿免疫固定电泳（L轻链）•尿免疫固定电泳可见轻链λ型M蛋白•骨髓涂片：可见骨髓瘤细胞•该病人确诊为轻链型多发性骨髓瘤国际骨髓瘤基金会2013推荐的M蛋白早期筛查流程尿蛋白检测---肾病肾病的临床特征•隐匿性发病•就诊晚–早期就诊率仅20-30%–部分患者首诊即终末期•发病率逐年增加–高血压、糖尿病–自身免疫病，肾小球肾炎•肾功能衰竭是共同终点慢性肾病已经成为沉重的社会和家庭负担57蛋白与肾脏生理蛋白与肾脏生理白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白微量免疫球蛋白，转铁蛋白，白蛋白肾小球滤过白蛋白转铁蛋白免疫球蛋白小分子蛋白小分子蛋白肾小管重吸收微量免疫球蛋白，转铁蛋白，白蛋白尿液肾性蛋白尿的肾脏排泄示意图鉴别肾单位病变部位的蛋白标志物指标：分子量•大小分子量蛋白鉴别标准–白蛋白：67KDa•大分子量蛋白–肾小球损伤•小分子量蛋白–肾小管损伤琼脂糖电泳在肾病中的应用尿本周氏蛋白电泳尿SDS蛋白电泳HYDRAGEL5PROTEINURIE主要的尿蛋白电泳条带区域分析起源于肾小管的各类蛋白(分子量67kDa)起源于肾小球的各类蛋白(分子量67kDa)白蛋白(分子量:67kDa)a1-微球蛋白(MW:33kDa)游离轻链(MW25kDa)转铁蛋白(MW:80kDa)Cystatin(MW:11kDda)b2-微球蛋白(MW:12kDa)溶菌酶(MW:15kDa)视黄醇结合蛋白(MW:21kDa)游离轻链的二聚体(MW50kDa)IgG(MW:160kDa)IgA(MW:165kDa)结合珠蛋白加样位置a2-巨球蛋白(MW:900kDa)SDSSDS+-分子筛原理：分子量排列SDS：十二烷基磺酸钠SDS尿蛋白电泳图谱SDSSDS+-分子量标记(kDa)14.430436794低分子量(67kDa)高分子量(67kDa)白蛋白(67kDa)分子筛•病因–糖尿病–感染性损伤(细菌感染,乙肝患者,水痘,梅毒,单核白血球增多症,…)–其他系统性疾病(自动免疫系统,癌症,…)–中毒现象(重金属,药物中毒,…)•白蛋白和大分子量蛋白肾小球性蛋白尿肾小球性蛋白尿67kDa白蛋白67kDa肾小管性蛋白尿•肾小管损伤将会改变其对小蛋白分子的重新吸收能力(小于67kDa的蛋白)•产生原因–遗传原因(Fanconi’ssyndrome,Bartler’ssyndrome)–代谢性疾病(糖尿病,草酸中毒)–免疫球蛋白单克隆扩增(myeloma,Waldenström)–药物作用(氨基甙类抗生素)–中毒(金属中毒,氨基甙类)67kDa67kDa67kDa67kDa67kDa67kDa67kDa67kDa肾小管性蛋白尿混合性蛋白尿67kDa67kDa67kDa67kDaSDS尿蛋白电泳图谱分析68SDS尿蛋白电泳15号样本BJ电泳尿蛋白电泳的联合应用尿本周氏蛋白电泳游离kappa尿蛋白检测到游离轻链SDS非浓缩尿蛋白电泳检测的优势1.敏感性高：检测限为15mg/L2.标本收集：随机尿，无需浓缩(推荐晨尿)3.检测结果尿蛋白的全貌直观反映肾脏受损部位对不愿意进行肾穿检查的病人,可作为替代实验4.动态观察：对确诊或不典型患者可进行动态观察SDS尿蛋白电泳、本周氏蛋白检测对象•血尿、浮肿•尿量改变(增加或减少)•不明原因水肿•尿蛋白阳性•血清蛋白电泳提示“M蛋白”•尿SDS蛋白电泳提示“轻链”存在•尿沉渣异常•高血压、糖尿病、自身免疫病患者•骨髓瘤患者。。。。。。脑脊液电泳脑脊液（CSF）介绍•脑脊液是存在于脑室及蛛网膜下隙内的一种无色透明液体•功能–在中枢神经系统起着淋巴液的作用–供应脑细胞一定的营养–运走脑组织的代谢产物–调节着中枢神经系统的酸碱平衡–缓冲脑和脊髓的压力，具有保护和支持作用病理性脑脊液蛋白产生机制•渗透-血液-脑脊液屏障（血脑屏障，BBB）通透性增加•鞘内合成-免疫球蛋白合成•两种机制并存常见的5种图型正常IgG鞘内合成IgG鞘内合成无鞘内合成无鞘内合成(但是有单克隆)结果