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研究用CodeNo.R045A说明书PrimeSTAR®MaxDNAPolymerasev201409Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●PCR反应液的配制1●PCR反应条件1●最适参数的设定2●PrimeSTARMaxDNAPolymerase的特点3●扩增产物的AgaroseGel电泳、克隆和测序7●Troubleshooting8●关联产品8●制品说明PrimeSTARMaxDNAPolymerase不仅兼备了PrimeSTARHSDNAPolymerase所具有的高扩增效率、高灵敏度和高特异性功能，还是迄今为止世界上延伸速度最快的、保真性能最高的PCR用DNA聚合酶。制品本身具有的高退火效率和独自开发的延伸因子使引物的退火时间和延伸时间大幅缩短，实现了PCR反应的高速化。同时，针对由于核酸含量较高而难以扩增的反应体系，也只需正常设定延伸时间即可进行扩增，大大简化了操作过程。本制品是添加了在常温下能够抑制DNAPolymerase活性和3’→5’exonuclease活性的抗体的HotStart型DNA聚合酶。同时反应各组分已经配制成预混型的2×Premix，在常温下可以快速配置反应液。●制品内容（100次量）PrimeSTARMaxPremix（2×）625μl×4*Mg2＋浓度为2mM（2×），dNTP浓度是各0.4mM（2×）。●保存：-20℃。注意：反复冻融活性可能降低。●PCR反应液的配制（Total50μl）试剂使用量终浓度PrimeSTARMaxPremix（2×）25μl1×Primer110~15pmol0.2～0.3μMPrimer210~15pmol0.2～0.3μMTemplate＜200ng*灭菌蒸馏水Upto50μl*请参照最适参数的设定。注意：PCR反应液的配制可在室温下进行，但DNA聚合酶等试剂在配制前请于冰上放置。●PCR反应条件使用PrimeSTARMaxDNAPolymerase进行快速扩增反应时，为了发挥延伸因子的最大效率，建议使用3StepPCR反应条件。（A）DNA量为200ng/50μl以下的PCR反应体系*98℃10sec.55℃5sec.or15sec.30～35Cycles72℃5sec./kb（B）DNA量为200ng/50μl以上的PCR反应体系*98℃10sec.55℃5sec.or15sec.30～35Cycles[3-stepPCR]72℃30~60sec./kbor98℃10sec.68℃30~60sec./kb*以反转录反应产物为模板进行高速PCR反应时（延伸速度为5～10sec./kb），在50μl反应体系中，cDNA的使用量为相当于125ngTotalRNA以下。设定的延伸时间延长（延伸速度提高到1min./kb）时，50μl反应体系中模板的使用量可增加至相当于约750ngTotalRNA的量。-1-30～35Cycles[2-stepPCR][请参照PrimeSTARMaxDNAPolymerase的特点：模板使用量与反应速度（cDNA为模板时）]●变性条件使用98℃时，建议设定为5～10sec.；使用94℃时，建议设定为10～15sec.。●退火温度请先设为55℃。●退火时间Tm值（按照下面的公式计算）为55℃以上时，设定为5sec.；Tm值（按照下面的公式计算）为55℃以下时，设定为15sec.。※Tm值的计算方法Tm值（℃）＝2（NA＋NT）＋4（NC＋NG）−5此公式适用于25mer以下的Primer。Primer超过25mer时，退火时间设定为5sec.。＜重要＞由于本制品是具有高退火效率的DNA聚合酶，退火时间一般设定为5sec.或15sec.。退火时间不宜过长，退火时间过长会导致扩增产物电泳时出现Smear现象。3stepPCR出现Smear时，请尝试使用2stepPCR。其他请参照“最适参数的设定”和“Troubleshooting”部分内容。●最适参数的设定为了发挥PrimeSTARMaxDNAPolymerase的最大性能、获得良好的PCR扩增结果，需要设定最适反应参数。（1）模板DNA使用量*【50μl高速（5sec./kb）PCR反应体系中，模板DNA的推荐使用量】人基因组DNA5ng～200ng大肠杆菌基因组DNA100pg～200ngλDNA10pg～10ng质粒DNA10pg～1ng50μlPCR反应体系中模板DNA量超过200ng时，延伸时间设定为30～60sec./kb，可获得良好的扩增效果。以反转录反应产物为模板进行高速（5～10sec./kb）PCR反应时，在50μl反应体系中cDNA的量设定为相当于或小于TotalRNA25-125ng。[请参照PrimeSTARMaxDNAPolymerase的特点：C.模板使用量与反应速度（以cDNA为模板时）]经亚硫酸氢盐处理后的含有尿嘧啶的DNA为模板时，不能使用本制品。（2）扩增片段大小进行5sec./kb的高速扩增反应时（反转录反应产物为模板时，按5～10sec./kb设定）可获得良好的扩增结果，可扩增的DNA片段大小分别为：人基因组DNA～6kb大肠杆菌基因组DNA～10kb反转录反应产物（cDNA）～6kbλDNA～15kb扩增片段超过上述长度时，可以尝试延伸时间设定为15～30sec./kb。PCR扩增成功与否也受模板的使用量、模板纯度、靶基因序列等因素影响。（3）Primer与PCR反应条件最好利用专业引物设计软件选择最适的引物序列，如OLIGO™PrimerAnalysisSoftware(MolecularBiologyInsights,Inc.)。-2-一般引物长度为20～25mer即可获得良好的扩增，当扩增大片段DNA时，使用的引物为25～30mer可获得良好的扩增。根据［PCR反应条件］选择反应条件。使用PrimeSTARMaxDNAPolymerase时，避免使用含次黄嘌呤核苷碱基（Inosine）的引物。（4）退火条件根据［PCR反应条件］设定退火条件。PCR扩增不良时请进行以下调整。＜产生Smear和杂带时＞①缩短退火时间。如果退火时间设定为15sec.时改为5sec.。②退火时间已设定为5sec.时，将退火温度提高至58～63℃。③使用2stepPCR法。＜无目的扩增产物或目的扩增产物量少时＞①延长退火时间。如果退火时间为5sec.时设定为15sec.。②将退火温度降低至50～53℃。●PrimeSTARMaxDNAPolymerase的特点A、扩增速度（1）以λDNA为模板扩增1kb-10kb片段时，退火时间设定为5sec.，延伸时间设定为10sec.或30sec.。TemplateλDNA1ng/50μlPCR仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice98℃10sec.PCR反应条件55℃5sec.30Cycles72℃10or30sec.【延伸时间10sec】【延伸时间30sec】M：λ-HindIIIdigest延伸时间为10sec.和30sec.时，分别可以良好地扩增6kb和8kb的DNA片段，说明以λDNA为模板的PCR反应体系可以将延伸时间按照5sec./kb设定。（2）以人基因组DNA为模板扩增0.5kb-7.5kb片段时，退火时间设定为5sec.，延伸时间设定为10sec.或30sec.。Template人基因组DNA100ng/50μlPCR仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice-3-M1246810M(kb)M1246810M(kb)98℃10sec.PCR反应条件55℃5sec.30Cycles72℃10or30sec.【延伸时间10sec】【延伸时间30sec】M：λ-HindIIIdigest延伸时间为10sec.和30sec.时，分别可以良好地扩增4kb和6kb的DNA片段，说明以人基因组DNA为模板的PCR反应体系可以将延伸时间按照5sec./kb设定。（3）以cDNA为模板扩增1kb-6kb片段时，退火时间设定为15sec.，延伸时间设定为10sec.或30sec.。TemplatecDNA（相当于100ngTotalRNA）/50μlPCR仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice98℃10sec.PCR反应条件55℃15sec.30Cycles72℃10or30sec.【延伸时间10sec】【延伸时间30sec】M：λ-HindIIIdigest延伸时间为10sec.和30sec.时，分别可以良好地扩增2kb和4kb的DNA片段，说明以cDNA为模板的PCR反应体系可以将延伸时间按照5～10sec./kb设定。B、扩增片段大小以λDNA、大肠杆菌基因组DNA、人基因组DNA和cDNA为模板时，退火时间设定为5sec.或15sec.，延伸时间按照5sec./kb设定（cDNA为模板时设定为10sec./kb），可得到各DNA扩增片段。-4-M1246M1246M(kb)M0.5123467.5M(kb)M0.5123467.5M(kb)TemplateλDNA1ng大肠杆菌基因组DNA50ng人基因组DNA100ngcDNA相当于100ngTotalRNAPCR仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice98℃10sec.PCR反应条件55℃5sec.or15sec.30Cycles72℃5or10sec./kb【λDNA】【大肠杆菌基因组DNA】M：λ-HindIIIdigest【人基因组DNA】【cDNA】M：λ-HindIIIdigest-5-延伸速度为5sec./kb的高速PCR反应，可以良好地扩增15kb的DNA片段。延伸速度为5sec./kb的高速PCR反应，可以良好地扩增10kb的DNA片段。延伸速度为5sec./kb的高速PCR反应，可以良好地扩增6kb的DNA片段。延伸速度为10sec./kb的高速PCR反应，可以良好地扩增6kb的DNA片段。M12468101215M(kb)M246810M(kb)M0.5123467.5M(kb)M12468M(kb)C、模板使用量与反应速度（cDNA为模板时）使用各种浓度的TotalRNA进行反转录反应，以获得的cDNA作为模板，扩增TransferrinReceptor（TFR）基因4kb片段，其延伸时间分别设定为20sec.（5sec./kb）、2min.（30sec./kb）和4min.（1min./kb），并对扩增效率进行了比较。50μlPCR反应体系中的模板使用量1：相当于25ngTotalRNA5：相当于500ngTotalRNA2：相当于50ngTotalRNA6：相当于750ngTotalRNA3：相当于125ngTotalRNA7：相当于1μgTotalRNA4：相当于250ngTotalRNAM：λ-HindIIIdigest延伸速度为5sec./kb的高速PCR反应时，50μlPCR反应体系中，模板使用量应少于125ngTotalRNA相当量。延伸时间延长（～1min./kb）时，cDNA的使用量可提高至750ngTotalRNA相当量。D、灵敏度分别以人基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA、λDNA和plasmidDNA为模板，延伸时间设为20sec.，扩增4kb的目的DNA片段，确认反应灵敏度。PCR仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice98℃10sec.PCR反应条件55℃5sec.30Cycles72℃20secM：λ-HindIIIdigest-6-M1234567M1234567M1234567M5sec/kb30sec/kb1min/kbM1234M1234M1234M1234M人基因组大肠杆菌基因组λDNAplasmidLane1Lane2Lane3Lane4基因组DNA100pg1ng10ng100ng大肠杆菌DNA1pg10pg100pg1ngλDNA100fg1pg10pg100pgplasmidDNA100f