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第一部分：基片的制备第二部分：点样第三部分：杂交第四部分：显色系统与信号检测第一部分：基片的制备基片是生物芯片的基础，是生化反应的载体。生物芯片以其基片的不同可以分为无机基片和有机合成物基片。前者主要包括玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠，其上的探针主要以原位聚合的方法合成；后者主要有特定孔径硝酸纤维膜、尼龙膜和凝胶块等，其上的探针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置或仪器滴加到基片上去(20-22)。在选择固相载体时，应考虑其荧光背景的大小、化学稳定性、结构复杂性、介质对化学修饰作用的反应、介质表面积及其承载能力以及非特异吸附的程度等因素。因此制作生物芯片的载体材料必须以下特征：良好的生物兼容性；足够的稳定性，能够抵抗一定热、酸、碱等条件；表面活性，表面应具有各种活性基团，以便与各种生物分子连接；良好的光学性质。基片在使用前一般需活化处理。活化试剂EDC、NHS等通过化学反应在载体表面键合上活性基团如氨基、环氧化物、巯基、醛基、肼基，以便于与配基相结合，形成具有生物特异性的亲和载体，用于固定生物活性分子，如蛋白质、核酸、多肽等。不同的载体就有不同的活化方式，玻璃基片常采用氨基、醛基、巯基这三种修饰方式。主要材料：玻璃片：普通无色玻璃，规格75×25×1mm质量要求：主要设备仪器：通风厨一个、烘箱一台氨基修饰基片的处理流程：1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）玻片的硅烷化：将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)的无水乙醇溶液浸泡30分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）烘干。3）氨基表面的活化：(1)酰化反应：硅烷化的玻片浸于lmmol二异丙基乙胺和1mmol丙烯酰氯的无水二氯乙烷溶液中摇晃反应2h，随后用二氯乙烷清洗，烘干。(2)氨化反应：1mmol氨化反应液的配制：0.67ml的四乙基五胺、0.65ml1.4-对-(3-氨丙氧基)-丁烷、0.56ml4-氨甲基-1,8-辛二胺、0.66ml4.7.10-三氧-三二唑啉硫酮二胺、0.52mlN,N-二甲基-1,6-已二胺、0.30ml2-(2-氨乙氧基)乙醇、0。02lml氨基-1,2-丙二醇和0.73mlJefamine八种氨基化合物溶解于l00ml无水的二甲基甲酰胺(DMF)中，将酰化好的玻片置于氨化反应溶液中过夜，反应时摇晃，然后玻片依次用DMF、甲醇和丙酮清洗，烘干。以上两个反应可以重复．直至所需的连接分子衍生在玻片表面。(3)表面活化：将上述氨化液处理的玻片用次亚苯基二异硫氰酸盐溶液（phenylenediisothiocyanate，PDITC)活化2h，192mgPDITC溶于40ml含l0％无水吡啶的DMF中，然后用DMF，二氯乙烷清洗．干燥。4）暗盒备用保存醛基修饰芯片的处理流程：1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）玻片的硅烷化：将清洗后的玻片放入10mM氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilaneAPES)的无水乙醇溶液浸泡30分钟。用无水乙醇反复清洗几次，晾干后放入烘箱（100-110℃）烘干。3）玻片的醛基化修饰：将硅烷化的玻片放入10mM对苯二甲醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清洗几次、晾干。注：此处参考一种醛基修饰的基因芯片基片及其制备方法。百傲目前使用的此方法。或：将硅烷化的玻片放入5%戊二醛的丙酮溶液中浸泡30分钟。取出，用超纯水清洗几次、晾干。4）暗盒备用保存。巯基修饰芯片的处理流程1）玻片的清洗：取普通载玻片放入95%的浓硫酸与5%重铬酸钾的溶液中浸泡过夜。用蒸馏水洗净玻片，浸入25%的氨水中，过夜。取出玻片，超纯水洗净，晾干。2）巯基化修饰：取玻片无水乙醇冲洗后浸入MEA（1%3-巯基丙基三甲氧基硅烷，95%乙醇，16mM乙酸）溶液中1个小时，再于95%乙醇与16mM乙酸(pH4.5)溶液中浸泡5分钟，迅速放入干燥的氮气中室温过夜。第二部分：芯片的点样主要设备仪器：点样仪一台1．点样的基本要求：片基大小：标准载玻片25mmX76mm点样面积：最大22mmX73mm点样方式：接触式（针式）或非接触式（喷式）样点大小：75~300微米（直径）样点间距离：100~300微米点样密度：1000~10000点/平方厘米点样精度：CV5~10%点样速度：5~20片/分钟定位精度：±10um2．点样的流程：1）点样液的配置：点样液常用的有三种：50%DMSO或3XSSC或商用的点样液。用点样液体配置点样样品（探针），点样浓度一般在10-30uM。2）点样样品放置与96或384孔板3）用点样仪器将点样样品点样于基片表面4）点样后将芯片放置37℃潮湿环境12小时固定5）固定后芯片用洗涤液（0.2%SDS）洗涤后用封闭液（NaBH4）封闭5分钟后用超纯水清洗，氮气吹干或离心甩干。6）帖标签后保存备用3．点样的注意事项：1）点样样品应该无颗粒、无沉淀，溶质均一，溶解于适宜的点样缓冲液中，用于制备样品的试剂要经过过滤、除菌。2）根据不同型号的点样仪，选择适宜的盛放容器存放点样样品，存放体积参照以下标准：1.30ul384孔板，盛放体积最小6ul，最大10ul，适用于Cartesian点样机。标准体积10ul。2．60ul384孔板，盛放体积最小15ul，最大25ul，适用于Pharmacia点样机。标准体积20ul。3．120ul384孔板，盛放体积最小10ul，最大30ul，适用于GeneMachine点样。标准体积20ul。注：每台点样仪均有推荐配套的384孔板，不能随意选择。3）样品浓度要适宜，不要太高或太低，浓度太高，容易堵塞针孔；4）不要点强酸、强碱、有机类。如：甲醇、氯仿等，设备受到腐蚀后会导致精确度降低。5）为了保证点样的质量，样品送点样之前，对样品体积进行调整，应该确保同一次点样的样品体积基本一致。6）点样样品应该有使用记录单，记录点样样品的使用情况，多次使用后的样品体积变化大，影响点样效果。7）样品在容器中的摆放位置，要与点样阵列的排放方式相对应，与点样时所用针数等参数相关。8）将点样样品转移到96孔板或384孔板后，需要在离心机上短暂离心，使样品沉淀到底部，盖上塑料膜，点样或－20℃保存。第三部分杂交（参考第四部分）主要设备仪器：杂交仪或烘箱第四部分显色系统与信号检测1.荧光信号系统2.纳米金银染法3.基于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶的底物底物化学发光系统3.1AP（碱性磷酸酶）与其底物AMPPD：DioxetanePhosphate（简称AMPPD），中文名为1，2-二氧环已烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点：反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。在通常情况下，这种化合物很稳定。但是，结果有碱性磷酸酶存在，DioxetanePhosphate作为酶的底物会在酶的催化一脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体。这个中间体随即自行分解（二氧四节环断裂），同时发射光子。仪器通过光电倍增管检测反应的发光强度。4.基于碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶的底物显色系统主要设备仪器：烘箱、普通光学扫猫仪1）武汉病毒所-芯片的酶联显色检测法试剂：（1）溶液I：10mMTris-HCl,pH7.5;150mMNaCl,0.05%Tween-20（2）溶液II：100mMTris-HCl,pH7.5;150mMNaCl,50mg/mlBSA（3）碱性磷酸酶-亲和素复合物或碱性磷酸酶-连接肽-链霉结合肽-链霉亲和素复合物（4）BCIP/NBT（200ug/ml）步骤：（1）带有生物素标记的PCR产物与固定探针的芯片进行杂交（2）采用碱性磷酸酶-亲和素复合物按下述步骤进行酶标信号检测：①用溶液I在37℃下漂洗芯片5分钟，除去非特异性结合于芯片上带有生物素标记的PCR产物。②用溶液II在37℃下封阻芯片10分钟，防止碱性磷酸酶-亲和素复合物在芯片上非特异吸附。③用碱性磷酸酶-亲和素复合物37℃下在芯片上作用10分钟，使其与生物素充分结合。④用溶液I在37℃下漂洗两次，10分钟每次，洗脱非特异结合于芯片上的碱性磷酸酶-亲和素。⑤在芯片上滴加BCIP/NBT（200ug/ml），37℃下反应30min。2）冶金所-芯片的酶联显色检测法（百傲参考的方法）试剂：（1）EasyHyb（roche）（2）洗液I：150mMNaCl,15mM柠檬酸钠,0.1%SDS（3）洗液II：100mM马来酸（Maleicacid）,150mMNaCl,0.3%Tween22,pH7.5（4）抗体：0.15U/mlAnti-Digoxigenin-Ap或Anti-Biotin-Ap，1%(w/v)BlockingReagent（roche）（5）平衡液：100mMTris-HCl,100mMNaCl,pH9.5（6）显色液：BCIP/NBTSolution（roche）步骤：（1）带有生物素或地高辛标记的PCR产物加入杂交液后与固定探针的芯片进行杂交（2）用洗液I在室温下漂洗芯片10分钟。（3）用洗液II在室温下平衡1分钟。（4）用抗体室温下作用30分钟，使抗体与地高辛或生物素充分结合，同时封阻蛋白非特异位点。（5）用洗液II室温漂洗1分钟。（6）用平衡液在室温下平衡1分钟。（7）芯片上滴加显色液，37℃30-60分钟。3）博星-芯片的酶联显色检测法试剂：（1）溶液I：8×SSC,0.4%SDS（2）POD稀释液：用溶液I和水稀释Streptavidin-POD(roche)（0.5ulPOD+25ul溶液I+75ulH20）（3）溶液II：0.5×SSC,0.1%SDS（4）溶液III：0.1mol/L柠檬酸钠，PH5.0（5）显色液配方：10ml溶液III，0.125mlTMB(roche)，6ul溶液IV（3％H2O2）步骤：（1）带有生物素或地高辛标记的PCR产物加入经75℃预热的溶液I（例9ulPCR产物+3ul溶液I）,混匀，94℃变性移至冰上，取样品全部加到芯片点样区域，48℃杂交30分钟。（2）用0.25×洗液I在室温下振荡漂洗芯片2分钟。（3）点样区滴上POD稀释液，作用5分钟。（4）用洗液II室温漂洗2分钟，洗两次。（5）芯片转入显色液中，显色5分钟。注：3,3’5,5’-四甲基联苯胺二盐酸(3,3´,5,5´tetramethylbenzidine,TMB)为过氧化物酶底物，常用作ELISA等免疫检测的显色剂。TMB被过氧化氢氧化时（由HRP催化）可形成蓝色产物，主要吸收峰在370nm和652nm。加入硫酸等酸性终止液后，变成黄色，最大吸收峰为450nm。