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多糖的检测方法关于多糖含量测定，业内有两种评价方法。一种是狭义上严格的多糖测定，即水提取多糖后，以凝胶色谱柱分离、洗脱提纯粗多糖得到较单一分子量的多糖，再水解成各种单糖，以HPLC法分离测定各单糖，即可得到比较严格意义上的多糖含量及其组成。这种方法是科研级的多糖测定。另一种评价方法一般是生产企业用于质控的多糖测定：一般过程是水提醇沉粗多糖后，以葡萄糖作为相比较的物质，加入特定显色剂后比色测定粗多糖的含量。注意，这种方法测得的是以葡萄糖作为折算的多糖含量。但这种评价方法简单实用，能反映一定的质量指标，作为质控之用可以的了。包括中国药典和一些国标、行标都采用此方法评价多糖含量，方法大同小异，如硫酸-苯酚法，硫酸-蒽酮法。但根据不少实际检验人的反映，要想检测结果有很好的重现性，还是有很多细节问题要注意的。粗多糖测定多糖的测定方法，目前有碱性酒石酸铜滴定法、比色法（蒽酮比色法、硫酸-苯酚法）。一般说来，比色法的优点是灵敏度高，样品用量少；但缺点是一般做常规检测时使用葡萄糖作标准品，误差较大，应以被测物的纯品作对照品，以求出换算因子，但要制备被测物的纯品并非每个实验室所能做到的，而且保健食品中往往是多种中草药的提取物作为原料而制成，所含多糖是不同相对分子量多糖的混合体，这就给提取纯品增加了难度。所以当成品中多糖含量大于1%（质量浓度）时，最好选用碱性酒石酸铜滴定。滴定法1.样品预处理取本品适量，精密称定，置于250ml磨口烧瓶中，精密加水50ml，称定重量，置沸水浴回流2小时，放置至室温，用水补足减失重量，混匀，滤过，精密吸取续滤液15ml于100ml离心管中，加无水乙醇75ml，混匀，以4000r/min离心10min，并小心弃去上清液,再加15ml热水(温度＞90℃)冲洗离心管中沉淀物,重复一次后再以4000r/min离心30min，弃去上清液，沉淀用乙醇液（水：乙醇=15：75）洗涤两次，离心，弃去洗涤液。2.样品水解将离心管中醇析物用50ml热水（温度＞90℃)少量多次转移至250ml磨口三角瓶中，加入15ml浓盐酸，开启冷凝管，在沸水浴中回流2h，冷却，先用40％的氢氧化钠（约15ml）粗调Ph值，后用稀的氢氧化钠溶液细调，再置于PH计上调整pH在6.8～7.2之间。将中和的酸解液移置至100ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀,过滤，滤液供滴定用。3.碱性酒石酸钾钠铜溶液标定3.1精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，加10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，用滴定管加入9.0ml葡萄糖标准溶液于锥形瓶中。3.2将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用标准葡萄糖溶液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，取其平均值（V1）。3.3样品溶液预测和测定。3.3.1样品溶液的预测精密吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5ml于150ml的锥形瓶中，精密加入10ml蒸馏水及2粒玻璃珠，控制在2分钟内加热至沸，保持溶液在微沸状态下以先快后慢的速度，从滴定管中滴加样品水解液液进行滴定，直至溶液蓝色刚好褪去为终点，记录葡萄糖标准溶液消耗体积。3.3.2样品溶液的测定精密吸取碱性酒石酸铜甲液与乙液各5.0ml，置于150ml锥形瓶中，精密加入蒸馏水10ml及玻璃珠2粒，从滴定管滴加比预测体积少1ml的样品水解液，将锥形瓶置电炉上迅速加热，务必在2分钟内至沸，并保持溶液在微沸状态下再用样品水解液滴定，以每2秒1滴的速度滴定至蓝色刚好褪去为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。同法平行操作三份，得出平均消耗体积（V2）。最后计算结果乘以0.9，此为葡萄糖换算成粗多糖的细数。硫酸-苯酚比色法1、方法提要食品中相对分子质量1×104的高分子物质在80%乙醇溶液中沉淀，与水溶液中单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性地从其他高分子物质中沉淀具有葡聚糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其显色强度与粗多糖中葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖含量。方法原理：粗多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定样品在粗多糖含量。2、主要仪器（1）分光光度计；（2）离心机（3000r/min）；（3）旋转混匀器。3、试剂本方法所用试剂除特殊注明外，均为分析纯；所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。（1）乙醇溶液（80%）：20mL水中加入无水乙醇80mL，混匀。（2）氢氧化钠溶液（100g/L）：称取100g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1L，加入固体无水硫酸钠至饱和，备用。（3）铜试剂储备液：称取3.0gCuSO4•5H2O，30.0g柠檬酸钠，加水溶解并稀释至1L，混匀，备用。（4）铜试剂溶液：取铜试剂储备液50mL，加水50mL，混匀后加入固体无水硫酸钠12.5g并使其溶解。临用新配。（5）洗涤剂：取水50mL，加入10mL铜试剂溶液、10mL氢氧化钠溶液，混匀。（6）硫酸溶液（10%）：取100mL浓硫酸加入到800mL左右水中，混匀，冷却后稀释至1L。（7）苯酚溶液（50g/L）：称取精制苯酚5.0g，加水溶解并稀释至100mL，混匀。溶液置冰箱中可保存1个月。（8）葡聚糖标准储备液：准确称取相对分子质量5×105已干燥至恒重的葡聚糖标准品0.5000g，加水溶解，并定容至50mL，混匀，置冰箱中保存。此溶液1mL含10.0mg葡聚糖。（9）葡聚糖标准使用液：吸取葡聚糖标准储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。此溶液1mL含葡聚糖0.10mg。4、测定步骤（1）样品处理：a、沉淀粗多糖：准确吸取液体样品5.0mL，置于50mL离心管中，加入无水乙醇20mL，混匀5min后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，反复操作3~4次。残渣用水溶解并定容至5.0mL，混匀后，供沉淀葡聚糖。b、沉淀葡聚糖：准确吸取b项终溶液2mL置于20mL离心管中，加入100g/L氢氧化钠溶液2.0mL铜试剂溶液2.0mL，沸水浴中煮沸2min，冷却，以3000r/min离心5min，弃去上清液。残渣用洗涤液数毫升洗涤，离心后弃去上清液，反复操作3次，残渣用10%（体积分数）硫酸溶液2.0mL溶液并转移至50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。此溶液为样品测定液。（2）标准曲线的绘制：准确吸取葡聚糖标准使用液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL（相当于葡聚糖0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg）分别置于25mL比色管中，准确补充水至2.0mL，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却后用分光光度计在485nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。（3）样品测定：准确吸取样品测定液2.0mL置于25ml比色管中，加入50g/L苯酚溶液1.0mL，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10.0mL于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸2min，冷却至室温，用分光光度计在485nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定吸光度值。从标准曲线上查出葡聚糖含量，计算样品中粗多糖含量。同时做样品空白实验。5、结果计算X=[(m1-m2)×V1×V3×V5]/[m3×V2×V4×V6]式中X—样品中粗多糖含量（以葡聚糖计）（mg/g）；m1—样品测定液中葡聚糖的质量（mg）；m2—样品空白液中葡聚糖质量（mg）；m3—样品质量（g）；V1—样品提取液总体积（mL）；V2—沉淀粗多糖所用样品提取液体积（mL）；V3—粗多糖溶液体积（mL）；V4—沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液体积（mL）；V5—样品测定液总体积（mL）；V6—测定用样品测定溶液体积（mL）。6、准确度与精密度在不同食品中进行不同浓度的加标回收实验，回收率为87.8%~110.87%，不同实验室对同一样品进行10次测定结果的相对标准偏差为5.8%。中药总多糖含量测定（苯酚-硫酸比色法）供试品溶液的制备：①提取上清液：精密称取样品细粉2.2g（约相当于多糖0.22g），置烧瓶中，加水100ml置电炉上加热回流提取1.5h，放冷至室温，3000～4000rpm离心10min，收集上清液，用少量水分次洗涤烧瓶及离心管，同样离心收集上清液。②提取多糖沉淀：合并全部上清液置蒸发皿中，置电炉上小心加热（避免焦化）浓缩到约15ml，放冷至室温，加乙醇100ml，搅匀，放置使其沉淀15分钟。转移此溶液连同沉淀于离心管中，继续用少量80%乙醇以玻棒充分刮洗蒸发皿，洗液和沉淀同样转移至离心管中，以3000～4000rpm速度离心15min，弃去上清液，在离心管中加入少量80%乙醇，轻轻洗涤，同样离心弃去上清液（保留沉淀物）。然后将离心管（连同沉淀物）于50℃烘箱挥干乙醇（不能见到任何液体），然后加热水溶解沉淀，转移至250ml量瓶中，继续用热水以玻棒充分刮洗离心管，洗液同样转移至250ml量瓶中，放冷至室温，用水定容至刻度，摇匀，精密量取5ml置100ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀即得供试品溶液。标准曲线的制作：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖适量，加水配制成0.85mg/ml的贮备液。精密吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml分别置于50ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。再分别精密量取上述各稀释液2ml置具塞试管中，同时精密量取水2.0ml置另一具塞试管中，各管分别加5%苯酚溶液（新制）1ml，摇匀，然后迅速加入浓硫酸5.0ml，立即摇匀，于40℃水浴中保温30min，取出，置冰水浴中5min。以上述2.0ml水所制得的空白溶液做参比，于489nm波长处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度（μg/ml）为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。备注：在准确度要求不很高时，可用对照品一点法代替标准曲线，即对照品只做一个点（精密取5.0ml葡萄糖贮备液稀释至100ml得葡萄糖稀释液，然后进行苯酚-硫酸反应，测定吸收度）。样品测定：取供试品溶液2.0ml置具塞试管中，按“标准曲线的制作”项下同法加苯酚溶液和浓硫酸，测定吸收度。根据样品吸收度从标准曲线上读取葡萄糖浓度，再计算出样品中总多糖的含量（以葡萄糖计）。备注：如果采用对照品一点法，则根据吸收度比值计算样品中总多糖的含量。