荧光定量PCR手册

实时荧光定量PCR手册单管Assay96或384孔板384孔TaqMan®ArrayCardOpenArray®芯片上图显示的为实时荧光定量PCR常用的产品形式。162345实时荧光定量PCR基础知识数字PCR实验设计反应板制备数据分析疑难解析实时荧光定量PCR基础知识1实时荧光定量PCR基础知识11.1简介21.2实时荧光定量PCR概述31.3实时荧光定量PCR组分概述41.4实时荧光定量PCR分析61.5实时荧光定量PCR荧光检测系统101.6熔解曲线分析141.7参比荧光染料151.8污染预防161.9多重实时荧光定量PCR161.10内部质控品和参考基因181.11实时荧光定量PCR仪校准191lifetechnologies.com实时荧光定量PCR基础知识11.1简介聚合酶链式反应(PCR)是分子生物学领域功能最强大的技术之一。采用PCR技术，利用序列特异性寡核苷酸、热稳定性DNA聚合酶和热循环，可将DNA或cDNA模板内的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。在传统(终点)PCR中，扩增序列的检测和定量是在反应结束，即最后一次PCR循环完成后进行的，且需要PCR后分析，如凝胶电泳和图像分析。在实时荧光定量PCR(qPCR)中，每次循环均检测PCR产物。通过监测指数扩增期的反应，用户可以确定靶点的起始量，且精度极高。在理论上，PCR可呈指数型扩增DNA，使每个扩增循环中的靶分子数倍增。在PCR问世之初，科学家推断，通过与已知标准品进行比较，利用循环数和PCR终产物的量可以计算出遗传物质的起始量。为达到可靠定量的要求，实时荧光定量PCR技术得以问世。如今终点PCR主要用于扩增特定的DNA，用于测序、克隆及其它分子生物学技术。在实时荧光定量PCR中，每次循环结束后通过荧光染料检测DNA的量，荧光染料产生的荧光信号与生成的PCR产物分子(扩增片段)数直接成正比。利用反应指数期采集的数据，生成有关扩增靶点起始量的定量信息。实时荧光定量PCR使用的荧光报告基团包括双链DNA(dsDNA)结合染料或在扩增过程中掺入PCR产物的、与PCR引物或探针结合的染料分子。利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器，检测反应过程中荧光的变化。实时荧光定量PCR仪通过绘制荧光与循环数曲线，生成扩增曲线，表示在整个PCR反应过程中积聚的产物(图1)。实时荧光定量PCR的优点包括：•能够实时监控PCR反应的进程•能够精确测定每个循环的扩增片段数量，从而对样本中的起始材料量进行准确定量•具有更大的检测动态范围•在单管中实现扩增和检测，无需PCR后处理在过去的数年中，实时荧光定量PCR已成为DNA或RNA检测和定量的主要工具。采用上述技术，您可以实现精确的检测，其准确度低至2倍范围，起始材料的动态范围达6至8个数量级。图1.相对荧光与循环数。通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线，生成扩增曲线；因此，扩增曲线表示在实时荧光定量PCR实验过程中积聚的产物。用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的DNA靶序列。相对荧光循环数荧光阈值起始靶点基线荧光2实时荧光定量PCR基础知识11.2实时荧光定量PCR概述本部分将概括实时荧光定量PCR的步骤。实时荧光定量PCR是在标准PCR技术基础上演变而成，常用于定量样本中的DNA或RNA。利用序列特异性引物，可测定特定的DNA或RNA序列的拷贝数。通过检测PCR循环的每个阶段中扩增产物的量，实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列(DNA或RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。利用荧光探针或荧光DNA结合染料，采用实时荧光定量PCR仪检测荧光并完成PCR反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。实时荧光定量PCR的步骤实时荧光定量PCR反应的每个循环包括三个主要步骤。一般运行40个循环。1.变性：利用高温孵育将双链DNA“熔解”为单链，并松开单链DNA的二级结构。一般采用DNA聚合酶可耐受的最高温度(通常为95°C)。如果模板GC含量较高，则延长变性时间。2.退火：在退火过程中，互补序列有机会发生杂交，因此，应根据计算所得的引物熔解温度(Tm)，使用适当的温度(通常较引物的Tm低5°C)。3.延伸：在70-72°C之间，DNA聚合酶的活性最佳，引物延伸速度达每秒100个碱基。当实时荧光定量PCR中的扩增片段较小时，通常将该步骤与退火步骤合并，温度为60°C。两步法qRT-PCR两步法定量逆转录PCR(qRT-PCR)的第一步是采用逆转录酶(RT)将总RNA或poly(A)RNA逆转录为cDNA。采用随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物(GSP)完成第一链cDNA合成反应。为在实时荧光定量PCR应用中平均表示所有靶点并避免oligo(dT)引物的3’偏差，许多研究人员采用了随机引物或oligo(dT)和随机引物的混合物。cDNA合成采用的温度取决于所选的RT酶。逆转录完成后，将约10%的cDNA转移至单独的管中，完成实时荧光定量PCR反应。一步法qRT-PCR一步法qRT-PCR可在同一管内完成第一链cDNA合成反应和实时荧光定量PCR反应，简化了反应设置，并降低了污染的可能性。需要使用基因特异性引物(GSP)。这是由于在一步法操作中使用oligo(dT)或随机引物将生成非特异性产物，降低了目的产物的量。3lifetechnologies.com实时荧光定量PCR基础知识11.3实时荧光定量PCR组分概述本部分将概括实时荧光定量PCR实验的主要反应组分和参数。在本手册后面的部分，将更详细地介绍一些特殊的组分，如报告基团染料、参比荧光染料和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)。DNA聚合酶PCR的性能通常与热稳定性DNA聚合酶有关，因此酶的选择是反应成功的关键。影响PCR特异性的一个主要因素是TaqDNA聚合酶在低温下具有残留活性。在反应的设置中，引物可与DNA非特异性地退火结合，使得聚合酶合成非特异性产物。通过采用“热启动”酶，可最大程度地减少因引物错配形成非特异性产物的问题。采用热启动酶确保了在反应设置过程和初始DNA变性步骤中，DNA聚合酶无活性。逆转录酶逆转录酶(RT)同DNA聚合酶一样，亦是qRT-PCR成功的关键。选择一种不仅能够提供高全长cDNA产量且在高温下具有良好活性的RT至关重要。高温性能对于具有二级结构的RNA的变性同样极为重要。在一步法qRT-PCR中，可在较高温度下维持活性的RT使您能够使用具有高熔解温度(Tm)的GSP，提高了特异性，降低了背景。dNTP最好从同一供应商那里购买dNTP和热稳定性DNA聚合酶，因为在实验中使用不同供应商的试剂，常常会出现阈值循环(Ct)灵敏度下降的情况。镁离子浓度在实时荧光定量PCR中，氯化镁或硫酸镁的终浓度一般为3mM。这是大多数靶点的最佳工作浓度；但镁离子的最佳浓度范围为3至6mM。良好的实验技术不要低估良好的实验技术的重要性。反应的每个阶段(从模板制备到PCR后分析)最好使用专门的设备和解决方案。使用防气溶胶吸头和螺帽管有助于减少交叉污染问题。要获得严格的重复数据(理论上为三次重复)，需制备包含除样本外的所有反应组分的预混液。使用预混液可减少加样步骤，从而降低孔间污染及其它加样误差的几率。模板每次实时荧光定量PCR反应需使用10至1,000拷贝的模板核酸。这相当于大约100pg至1μg的基因组DNA或利用1pg至100ng总RNA生成的cDNA。多余的模板也可能提高污染物含量，大大降低PCR效率。PCR引物的特异性针对cDNA而非基因组DNA，处理RNA模板以降低其包含基因组DNA污染的几率十分重要。一种方案是采用DNA酶I处理模板。纯的完整RNA是高质量全长cDNA合成的基础，也是实现准确的mRNA定量的关键。RNA应避免RNA酶污染，且应维持无菌状态。总RNA一般适用于qRT-PCR；通常无需mRNA提取，但提取mRNA可提高特定cDNA的产量。4实时荧光定量PCR基础知识1实时荧光定量PCR引物设计良好的引物设计是实时荧光定量PCR的最重要参数之一。这正是众多研究人员选择购买TaqMan®Assay产品的原因——这些引物和探针采用了成熟可靠的算法设计，获得了全世界科学家的信赖，适用于实时荧光定量PCR。如果您选择设计您自己的实时荧光定量PCR引物，切记扩增片段的长度应约为50–150bp，因为较长的产物无法实现高效扩增。一般而言，引物的长度应为18–24个寡核苷酸。这是针对实际的退火温度的。引物应根据标准PCR指南设计。它们对于目的基因序列应是特异性的，且无内部二级结构。引物应不含共聚物延伸段序列(如poly(dG))或重复基序，因其可引起不必要的杂交。引物对应具有相当的熔解温度(在1°C以内)，且GC含量约为50%。高GC含量的引物可形成稳定的不良杂合体。相反，高AT含量会降低匹配良好的杂合体的Tm值。如果可能，引物的3’端应具有高GC含量(GC夹)，以提升延伸端的退火效率。分析引物对序列，避免引物之间的互补和杂交(引物二聚体)。在qRT-PCR中，设计内含子两侧可与外显子退火结合的引物(或覆盖mRNA相邻两个外显子交界处)，利用熔解曲线分析区分cDNA和潜在污染基因组DNA的扩增。要确认引物的特异性，可在公共数据库上进行BLAST搜索，以确保您的引物只识别目的靶点。想获得最佳结果，需要在50至500nM浓度间进行引物滴定。引物终浓度为200nM时能有效地进行大多数的实验。引物设计软件引物设计软件程序(如OligoPerfect™设计工具和PrimerExpress®软件)及序列分析软件(如VectorNTI®软件)可自动评估目的序列，并根据上述标准设计序列引物。使用引物设计软件至少可以确保引物针对目的序列的特异性，且不会形成内部二级结构，并能避免每条引物的3’端自身或与其它引物之间形成互补杂交。如前所述，在使用DNA结合染料进行扩增片段检测时，良好的引物设计尤为关键。5lifetechnologies.com实时荧光定量PCR基础知识11.4实时荧光定量PCR分析本部分定义了实时荧光定量PCR分析中常用的术语。基线实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中(一般为第3至15个循环)的信号水平，此阶段的荧光信号变化极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或“噪声”(图2)。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。应仔细设置基线，以准确确定阈值循环(Ct)(定义如下)。基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。当比较不同的实时荧光定量PCR反应或实验时，应采用同样的方法确定基线(图2)。阈值实时荧光定量PCR反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加(图2)。设置阈值可将相关扩增信号从背景中区分出来。实时荧光定量PCR仪软件通常将阈值自动设置为基线荧光值标准差的10倍。但阈值可设置在PCR指数期的任意点。Ct(阈值循环)阈值循环(Ct)是反应的荧光信号与阈值交叉的循环数。Ct值可用于计算起始DNA拷贝数，因为Ct值与起始靶点量呈反比。例如，比较含有不同靶点量的样本的实时荧光定量PCR结果时，如果第一个样本扩增前起始的靶基因拷贝数是后一个样本的两倍，较之第二个样本，第一个样本可提早一个循环生成Ct(图3)。前提是上述两个反应的PCR的工作效率均为100%(即每个循环后产物量均实现倍增)。模板量越低，出现明显扩增的循环数越高。模板按10倍稀释，则Ct值递减3.3个循环。标准曲线利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率(图4)。以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标(x轴)，该浓度对应的Ct值为纵坐标(y轴)，绘制曲线。从该标准曲线中可以推导出反应性能及各种反应参数(包括斜率、y截距和相关系数)相关的信息。标准曲线中所选的浓度应涵盖实验样本的预期靶点浓度范围。  图2.实时荧光定量PCR反应的基线和阈值。图3.10倍连续稀释的扩增曲线。  阈值基线循环数6