搜索
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003:世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。第二章DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。限制性核酸内切酶的功能与类型主要特征I型II型III型功能限切/修饰限切限切/修饰蛋白结构异源三聚体单体异源二聚体辅助因子ATPMg2+SAMMg2+ATPMg2+SAM识别序列TGAN8TGCTAACN6GTGC旋转对称序列GAGCCCAGCAG切割位点距识别序列1kb处识别序列内距识别序列下游24-26bp处其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。特点：1.识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。2.识别序列为4-6碱基对的回文对称结构（旋转对称结构）。3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。4.切割产物末端：5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度：大多为37℃,适盐浓度：高盐、中盐、低盐。8.当反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化（星号反应）。星活性（staractivity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。引起星活性的因素：①高浓度甘油（5%）、②酶过量（100U/g）、③低离子强度（25mM）④高pH(pH8.0)、⑤有机溶剂、⑥用其它二价阳离子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+,Zn2+。II型限制性核酸内切酶的命名具体规则是：以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体发现此酶的先后次序。例子：Eschericha（属名）coli（种名）R（质粒）大肠杆菌R质粒—EcoRIEcoRVHaemophilus（属名）influenzae（种名）d（株名）嗜血流感杆菌d株--HindIIHindIII。罗马数字表示同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。特殊性质的II型限制酶：同裂酶，同尾酶同裂酶：又称异源同序酶或异源同工酶，是指识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶识别相同序列，如HindIII–HsuI:A/AGCTT同尾酶：是指识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，如BglII：A/GATCT；BamHI:G/GATCC。同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。2.DNA连接酶（T4-DNA连接酶）功能：体外连接ＤＮＡ片段常用的连接酶：Ｔ４ＤＮＡ连接酶参与连接反应的基团：３端羟基和５端磷酸基团，形成磷酸二酯键DNA连接酶的基本性质：修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键、修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处的磷酸二酯键、连接多个平头双链DNA分子T4DNA连接酶的活性单位定义：在20μl反应体系中于16℃，使HindⅢ切过的DNA（300μg/ml，0.12μM5'末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。3.DNA聚合酶①大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）基本性质：1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性2.5‘→3‘的核酸外切酶活性3.3‘→5‘的核酸外切酶活性大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：1.切口平移标记法2.Nicktranslation3.制备32P标记的探针。所有的DNA聚合酶中只有此酶有该反应。缺口平移标记原理见ppt。大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow酶）：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow酶的基本用途：1.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端2.DNA片段的同位素末端标记3.cDNA第二链的合成4.双脱氧末端终止法测定DNA序列。②T4-DNA聚合酶基本特性：1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性(极强)2.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切3.在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位基本用途：1.切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端，该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。2.DNA片段的同位素末端标记。③依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）基本用途：1.以RNA为模板合成cDNA链2.双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链4.核酸酶单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）；双链核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）；双链核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）【特异性地从5‘端外切】；单链核酸内切酶：S1核酸酶【降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，比降解单链RNA快7倍】5．核酸修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）；碱性磷酸单酯酶【小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）&大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）】；T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）二、用于克隆的载体1.载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。载体应具备的条件：1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或结合位点3.具有较高的外源DNA的载装能力4.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点(多克隆位点)5.具有合适的筛选标记2.载体类型：（1）根据主要用途可以分为：克隆载体和表达载体①克隆载体：主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。克隆载体关键元件：A.多克隆位点B.筛选标记基因C.复制起始位点②表达载体：除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。（2）按传代特性分：①自主复制型载体：含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代（穿梭载体：装有针对两种不同受体的复制起点，便于基因克隆）。②整合型载体：不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。3.分子克隆载体常用类型：（1）质粒：15kb以下严紧型复制控制的质粒：1-5拷贝，如pSC101松弛型复制控制的质粒：30-50拷贝，如ColE1氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。质粒载体的特点：分子量小，便于操作；易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架；用途广泛；缺点：装载量小（小于10kb），不能用来克隆大片段。重要的大肠杆菌质粒载体：pBR322：松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数50–100/cell；用于基因克隆。还有pUC18/19；T载体，详见ppt，了解一下。实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：①氯化铯密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；②碱裂解法（最常用）：质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间；③沸水浴法：质粒DNA纯度底、快速、操作简便。质粒的不相容性的分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。质粒载体不稳定性的类型分离的不稳定性：在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞没有获得质粒DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体。结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。影响质粒载体稳定性的主要因素新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应；拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响——低差度-稳定/高差度-不稳定；寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应——形成重组质粒二聚体，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖。（2）lamda噬菌体DNA:25kbλ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳包装蛋白和l-DNA组成。DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态λ-DNA是线性双链DNA分子，全长48502个核苷酸。λ-DNA两端各带有一个12bp的粘性末端，称为cos位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状。①插入型载体：改造后的长度正好为包装的下限，因而本身也能被包装，叫插入型载体1.cI基因失活：cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。2.LacZ基因插入失活：在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。②取代型载体：长度为40kb，在非必需区域有酶切位点，距离为14kb。载量为10-25kb。用取代型载体克隆外源DNA可能需要经过哪些步骤？第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。第二，将上述所得的λDNA臂同外源DNA片段连接。第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。λ-DNA作为载体的优点：1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌2.λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量3.重组l-DNA分子的筛选较为方便4.重组λ-DNA分子的提取较为简便5.λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。cos质粒：lamdaDNA的cos区和质粒组成的载体:31-45kb（3）考斯质粒载体的特点：1.能像λ-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞2.能像质粒那样在受体细胞中自主复制3.重组操作简便，筛选容易4.装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围5.不能体内包装，不裂解受体细胞.（4）人工染色体载体人工染色体实际上是一种“穿梭”克隆载体：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。①细菌人工染色体（BAC）:50-300kb,主要用于基因文库构建——易于发生重组、缺乏稳定性