共聚焦显微镜

激光扫描共聚焦技术上海交通大学医学院郭强苏副主任技师激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜是80年代逐渐得到广泛应用，比较先进的细胞生物学分析仪器用激光扫描装置，通过计算机控制和处理获得细胞和组织内部微细结构的荧光图像观察细胞形态和细胞器及细胞内各种成分的细微变化，并可动态的检测胞内Ca2+、PH值、膜电位等生理信号激光扫描共聚焦显微镜的发展激光共聚焦显微镜是经过几十年的不断改进才逐渐发展起来的1957年马文闵斯基（MarvinMinsky)在美国首先阐明了共聚焦显微镜基本原理，提出了“共轭光路”1967年埃格尔（Egger)和佩特兰(Patran)成功用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面1979范德威欧瑞特（VaaderVoort)全面地描述了激光扫描共聚焦显微镜=标准消像差和色差光学透镜+高灵敏度探测器+产生特定波长的功率较大的激光器+高速度大容量的微机系统+精密的扫描装置激光扫描共聚焦显微镜种类1、台阶式激光扫描共聚焦显微镜2、狭缝式激光扫描共聚焦显微镜3、光束式激光扫描共聚焦显微镜4、双光子和多光子激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜原理激光扫描共聚焦显微镜的组成X-y扫描装置图像贮存扫描控制视频显示三维重建图像输出低噪音光电倍增管共焦针孔激光发射滤光片分光镜焦距同步Z轴方向步进电机x-y光门共焦针孔PMT增益滤光片轮激光共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的差别1、光源普通荧光显微镜汞灯、卤素灯及其他普通光源激光共聚焦显微镜激光（能量大、单色性好）2、光路激光共聚焦显微镜共轭光路（能抑制杂散信号）3、成像普通荧光显微镜照相机、CCD真彩激光共聚焦显微镜PMT（光电倍增管）伪彩激光与汞灯的差别激光单色性好、能量大XYZ轴有很高的分辨率须选择与激光波长匹配的荧光探针汞灯激发波长范围广无Z轴分辨率荧光探针选择范围广激光共聚焦显微镜对物镜的要求消球差——激光共聚焦显微镜图象要求在Z轴没有偏差消色差——激光共聚焦显微镜图象很多是应用不同的波长多通道扫描温度矫正—激光共聚焦显微镜可以进行活细胞的动态观察，需调整温度什么是球差？一个理想的物镜实际的球镜球差弥散斑无球差时有球差时影响显微镜成像质量的因素物镜（已知的）浸润的介质(不定的)不同的介质有不同的折光率，如在23度时物镜油的折光率是1.515左右盖玻片(不定的)玻璃的的折光率是1.5,但盖玻片的厚度有变化,因此要求其厚度控制在0.17mm标本(不定的)标本的景深有变化,其光密度不均匀,活细胞的折光率从1.33--1.38不等ZEISS510激光共聚焦显微镜系统的简介三根激光管、五个波长(351\364\458\488\543nm)三个荧光通道+一个透射通道可调控恒温平台高压汞灯像差微分干涉2.5、5、10、20、40、63、100倍大数值孔径物镜，20、40长工作焦距物镜数字胶片打印机、彩色喷墨打印机、光盘刻入机激光扫描共聚焦显微镜功能概述组织光学切片“细胞CT”共聚焦成像光路的共轭的原理，可有效抑制同一焦平面上的非测量点的杂散荧光及非焦平面上的荧光，因此具有深度识别能力（最大深度200--400um)，可以逐层获得高分辨率的光学横断面图像，从而对细胞和组织进行无损伤的系列光学切片（Opticalsectioning)COS细胞基因表达与鬼笔环肽共定位大鼠卵细胞的细胞骨架三维图像重建激光扫描共聚焦显微镜通过逐层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理软件及三维重建软件获得标本的三维立体结构，从而能灵活、直观地进行形态学观察，并揭示细胞结构的空间关系，测量细胞结构间的空间距离细胞结构和细胞器测定激光扫描共聚焦显微镜可进行低光测试、重复性极佳，能进行细胞和组织的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、纺锤体、细胞骨架、结构性蛋白、DNA、RNA、酶和受体进行定性定量测定动脉内皮细胞三标记染色细胞的有丝分裂（示纺锤体）荧光的定量定位分析激光扫描共聚焦显微镜有多个荧光通道和一个透射通道，可对荧光双标记或多标记的细胞和组织进行测试，同时还可以将荧光图像与像差图像重叠以显示荧光在形态结构上精确定位。激光扫描共聚焦显微镜也非常适用于高灵敏度的快速免疫荧光检测如荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridizationFISH)大鼠附睾组织（AO)染色动脉内皮细胞三标记染色培养细胞的免疫组化细胞内离子和膜电位的实时定量测定利用多种特异的荧光探针,激光扫描共聚焦显微镜可对细胞内各种离子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+）的浓度和膜电位及PH值动态变化作毫秒级的实时定量检测和分析，因此激光扫描共聚焦显微镜能完成对活细胞生理信号的动态检测急性分离心肌细胞在KCL作用下的胞内钙的变化光漂白后的荧光恢复FRAP(FluorescencerecoveryAfterPhotbleaching)FRAP细胞间通讯细胞内的物质的动态变化光漂白中的荧光损失FluorescenceLossinPhotbleaching（FLIP）光活化Photoactivation解笼锁Uncaging激光扫描共聚焦显微镜在医学中的应用举例激光扫描共聚焦显微镜在细胞凋亡中应用激光扫描共聚焦显微镜不但可用于凋亡细胞亚细胞水平的观察，还可以观察到细胞内某些超微结构的变化，在培养的K562细胞中加入放线菌素诱导细胞凋亡，并对细胞内DNA片断进行3‘--末端标记，经观察发现该细胞凋亡早期有大量DNA片断出现在对以血清剥夺法诱导的Balb/C373细胞的凋亡研究过程中，观察到凋亡细胞的肌动弹白丝变模糊，核周围的肌动弹白丝出现崩解现象本室研究了不同浓度的糖皮质激素对睾丸间质细胞凋亡的影响，发现一定浓度糖皮质激素能使睾丸间质细胞凋亡大量增加激光扫描共聚焦显微镜在肿瘤研究中的应用在肿瘤细胞研究中常采用荧光标记某些蛋白分子，测量其平均荧光强度和分布，从而对细胞某些结构和蛋白分子进行定量分析肿瘤细胞的凋亡与细胞因子和细胞内离子尤其钙离子浓度的变化关系密切，该显微镜为此类研究提供了方便准确的研究方法某些癌基因和化学物质是通过影响细胞间通讯来启动肿瘤细胞生长的，该显微镜可观察细胞间的连接蛋白、黏附因子的变化；测量细胞缝隙连接介导的分子转移；观察肿瘤启动因子和生长因子对细胞间通讯的作用；测定药物对细胞间通讯的影响等肿瘤细胞与受体的关系较为复杂，也是肿瘤研究的重点之一，采用激光扫描共聚焦显微镜可以方便地观察各种受体在细胞内的分布、空间位置，还可对受体进行定量测定激光扫描共聚焦显微镜在血液病学中的应用用激光共聚焦显微镜对用染色体特异性探针杂交定位的人T淋巴细胞进行观察，发现细胞周期的G1期着丝点分布在核膜周围，当细胞向G2期转化时，着丝点向核中央移位用激光共聚焦显微镜检测血小板受到外源性ADP刺激后Ca2+变化，发现刺激后Ca2+水平快速上升，并可被EGTA明显阻断，由此发现血小板受到刺激时Ca2+增加除了内Ca2+动员外，主要是摄取胞外Ca2+在急性早幼粒细胞白血病（APL）中，PML蛋白是存在在核小体内的与白血病发生密切相关的蛋白，它的受抑止可能会导致早幼粒细胞的生长失控，用该仪器发现干扰素可诱导PML蛋白的过度表达从而抑制白血病细胞生长鼠嗜碱性白血病细胞在受体激活后，细胞内Ca2+信号变化有空间特异性，变化首先发生在细胞周围的伪足，以后向细胞内扩展，最终传导到核内目前激光共聚焦显微镜应用较多方面1、细胞内多种离子的动态变化2、转染基因的定位（共定位）3、荧光原位杂交点的空间分布4、细胞膜及核膜受体5、细胞骨架6、细胞器的功能