体内药物分析复习提纲

11、与常规药物分析相比，体内药物分析有哪些特点？①干扰杂质多（内源性、外源性杂质，结合的、游离的，原形药物、代谢物）②样品量少（ng/ml—ug/ml），不易重新获得③对分析方法的灵敏度和专属性要求高④要求较快提供结果（临床用药监护，中毒解救等）⑤要有一定的仪器设备⑥工作量大2、影响血药浓度的因素有哪些？①机体因素生理因素（年龄、性别、妇女妊娠等）②病理因素胃、肠道疾病——影响吸收，肝脏疾病——影响代谢，肾脏疾病——影响排泄③遗传因素（代谢酶活性差异）④药物因素（剂型因素、手性药物对映体相互作用）⑤环境因素（化学物质和合并用药、人体昼夜节律、营养和精神状态）3、试述体内药物分析在药学领域中的作用和地位。体内药物分析采用分析的手段了解药物在体内数量与形态的变化，获得各种药物代谢动力学参数和药物转变、代谢的方式、途径等信息，从而有助于从药物的研究、生产、临床应用等各方面对所研究的药物作出评价，有助于药物的改进和发展。4、常用生物样本有哪些？如何采集、储存。血浆血样(blood)血清生物样本尿液(Urine)全血唾液(Saliva)血浆(plasma)全血+抗凝剂（肝素等）离心上清液血清(serum)全血离心上清液全血(wholeblood)全血+抗凝剂（肝素等）混合尿液：收集服药后一定时间内（8、12、24h）尿样，记录体积，混合均匀后取一定量,测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累计量（V×C）。唾液：漱口15min后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。样品的贮存：①冷冻贮存若样本采集后不能及时测定，可置4℃冷藏，若放置时间较长，则需-20℃～-80℃冷冻保存。血样——采血后尽快（不超过24h）分离出血浆、血清，再冰冻保存(-20℃)。尿液——主要成分是水、尿素、盐类，易长细菌，短期可置4℃冷藏或加防腐剂，若保存时2间长则需冷冻保存。②加稳定剂酶抑制剂：NaF，四氢尿苷，三氯醋酸抗氧剂：维生素C等③防腐剂、改变pH值尿样中可加入的防腐剂有：甲苯、氯仿等或加无机酸、碱等调节尿液pH值。冷冻的样品测定时需解冻，最好一次性测定完毕，不要反复冷冻解冻冷冻解冻，以免药物含量下降。5、生物样品测定前为什么要除去蛋白质？除去蛋白质的常用方法有哪些？除去蛋白的意义：①使结合型药物释放出来，以测定总浓度。②得到较“干净”的提取液，减少乳化。③消除对测定的干扰。去蛋白的方法：①蛋白质沉淀法生成不溶性盐酸类（TCA、HClO4等）重金属盐（Zn2+、Cu2+、Ag+）盐析和脱水中性盐（（NH4）2SO4、NaCl）能与水混溶的有机溶剂（甲醇、乙腈、丙酮）②组织酶消化法（蛋白水解酶）酶消化法是在一定的pH范围、一定的温度和一定的反应时间下完成的。其特点是：水解条件温和，水解效率高，无乳化生成。有时可合用一些蛋白酶增活剂，以减少酶用量和缩短消化时间。常用的酶：枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草菌溶素6、影响液-液提取和液-固提取效率的因素分别有哪些？影响液-液提取：①水相pH当pH=pKa时,50%药物以非电离形式存在，欲使药物以游离状态存在，则必须调整样本的pH值。碱性药物pH﹥pKa2~3个单位酸性药物pH﹤pKa2~3个单位水相最佳pH值可通过公式计算求出。Henderson—Hasselbalch公式②提取溶剂提取溶剂的选择既要考虑提取的选择性，同时也要考虑操作是否方便，在满足提取效率3的同时选取极性尽可能小的溶剂，使既有合适的回收率，又可将干扰物质降到最低。一般可根据相似相溶原则进行选择，选择沸点低的溶剂。当样品中药物性质未知时，可用乙醚、氯仿分别作为酸性和碱性药物的提取溶剂。③离子强度在水相中加中性盐，如NaCl，可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取。影响液-固提取效率：①洗脱液流速——流速太快，分离度下降，样品流失，回收率低，重现性差。②样品装载量——有效装载量取决于被测物的容量因子、固定相量和样品浓度同样的固相柱，容量因子大的化合物可装载较多的量。③样品的前处理血样——血清、血浆可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回收率。尿样——一般用水或缓冲液稀释后直接进行固相萃取。但有时需加入酸（碱性化合物）或碱（酸性化合物），加热15-20min，以水解结合物，或用酶水解来释放被结合的药物。细胞培养液——一般无需处理即可进行固相萃取，或上柱前先用水或缓冲液稀释。但若培养液中有颗粒则很难通过固相柱，须离心。7、如何根据所取样本、待测物的理化性质设计前处理方法？举例说明。血样——血清、血浆可直接上样进行固相萃取，但若药物与蛋白结合，则会降低萃取回收率，可采取下列措施：用0.1M的酸或碱调节pH至极限值（pH﹤3或pH﹥9），取上清液进行固相萃取。用乙腈、甲醇或丙酮沉淀蛋白，离心后取上层溶液，用水或缓冲液稀释，再用固相萃取。用蛋白质沉淀剂（酸、盐）沉淀蛋白，取上层溶液，调整pH后进行固相萃取。生物体液超声处理15min，加入水或缓冲液，离心，取上层溶液进行固相萃取。尿样——一般用水或缓冲液稀释后直接进行固相萃取。但有时需加入酸（碱性化合物）或碱（酸性化合物），加热15-20min，以水解结合物，或用酶水解来释放被结合的药物。细胞培养液——一般无需处理即可进行固相萃取，或上柱前先用水或缓冲液稀释。但若培养液中有颗粒则很难通过固相柱，须离心。例：庆大霉素血药浓度测定庆大霉素在体内不被代谢，以原型存在，蛋白结合率为30%.HPLC法时，没有共轭结构，故不能用紫外或荧光检测器。由于庆大霉素中含有多个游离氨基，荧光比紫外检测器灵敏度高，故选择邻苯二醛OPA荧光衍生试剂。庆大霉素与蛋白结合率低，在沉淀蛋白时较易释放。由于分子中的苷键在强酸条件下易水解，故不宜选用高氯酸等强酸除蛋白。庆大霉素水溶液在PH2-12范围内稳定，用乙腈或甲醇去蛋白时，上清液PH为8.5-9.5，因此可选这两种溶剂作为蛋白沉淀剂，特别乙腈具有弱碱性，药物-蛋白结合物在碱性下更易于释放，而且蛋白质经乙腈沉淀后形成团块状，易粘附于容器壁上，使上清液澄清便于用吸样器吸取、转移。庆大霉素结构上含多个羟基，使其具有较强的极性和水溶性，导致无法直接采用经典的液-液萃取法。但当采用柱前衍生化时，生成的衍生物可用溶剂萃取，萃取液直接进样或蒸干后加流动相或适当溶剂溶解后进样分析。萃取溶剂以乙酸乙酯较好。庆大霉素的强极性和解离性，使其更适合固相萃取分离，可采用硅胶和阳离子交换剂作为固相填料。当在萃取柱上直接衍生化后，生成的衍生物可用乙醇洗脱。预处理方法：乙醇沉淀血浆蛋白后，用OPA柱前衍生化，再以乙酸乙酯萃取荧光衍生4物。然后采用RP-HPLC分离，荧光检测血浆中庆大霉素浓度。8、基质效应产生的原因、影响、确认方法以及消除。原因：标本中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的影响，引起基质效应的因素相当复杂，涉及实验的多个部分：仪器设计、试剂组成、方法原理，以及质控物、定标物和PT材料的成分和处理技术。与标准样品和QC样品相比，生物样品在进行液相色谱-电喷雾电离-质谱法分析时，会产生明显的基质效应。产生于生物样品中的内源性物质、代谢产物或一同服用的其它药物，因在色谱分析中与目标化合物分离不完全或未被检测到而进入质谱后产生基质效应。影响：基质效应会使分析物的测定值发生改变，数值或偏大或偏小。而在生物样品（以血浆为例）中，引起基质效应的主要是磷脂、胆固醇等内源性物质。他们随同待测物从色谱柱上一起被洗脱出来，经离子源气化，进入质谱进行检测分析。而就在液滴气化、发生库伦爆炸变成小液滴直至产生气体离子的过程中，这些内源性的物质由于极性较大，会同待测物离子竞相竞争液滴表面，从而导致待测物的离子化效率降低或增强，引起响应降低或增高，这就产生所谓的基质抑制或基质增强效应基质效应的确认方法①标准曲线法②柱后灌注法③监控法基质效应的消除：①选择合适的样品制备方法——最有效。②改善色谱分析条件③优化质谱分析条件④内标的选择9、分析方法的确证包括哪些内容。准确度、标准曲线、精密度、萃取回收率、特异性、定量范围、灵敏度、生物介质重现性、生物介质效应、稳定性、分析批、标准样品、质控样品分析方法的验证，就是对药品分析实验所采用的分析方法是否完全达到了预期目的，或证明由分析方法误差而导致试验结果判断错误的概率是否在允许范围之内，而进行的科学证明。分析方法的验证以验证参数表示。①专属性（Specificity）：专属性是指在一些可能存在的组分如杂质、降解产物、基质等的存在下，对被分析物质的准确可靠的测定②准确性(Accuracy)：准确性指的是真实值或认可的参考值与测量值之间相近程度③精密度(Precision)：精密度指的是规定条件下对同一匀质样品多次取样进行一系列检测结果的一致程度（离散程度）。精密度可以从三方面考虑：重复性、中间精密度、重现性。分析方法的精密度通常以测量法的变异性、标准偏差或变异系数来表达。④重复性(Repeatability)：重复性是指在同样的操作条件下较短时间间隔的精密度：也称为日内差(Intra-assayprecision)。⑤中间精密度(IntermediatePrecision)：中间精密度指的是试验室内部条件改变（如：不同天、不同分析测试者、不同仪器等）情况下的精密度。⑥重现性（Reproducibility）：指不同试验室之间的精密度，常用于合作试验研究(collaborativestudies)中的方法学的标准化研究5⑦检测限度(Detectionlimit)：检测限度指的是样品中的被分析物质能够被检测到的最低量，通常无需定量。⑧定量限度(Quantitationlimit)：某种分析方法的定量限度是指具有合适准确性和精密度的条件下，能够定量测定分析组分的最低限量。它是样品中含量低的化合物定量分析的参数，特别适用于杂质和（或）降解产物的测定。⑨线性(Linearity)：分析方法的线性是指所得检测结果与样品中被分析物的浓度（含量）成比例关系的性能⑩范围(Range)：析方法的范围是指在样品中被分析物的较高浓度(量)和较低浓度(量)之间的区间、已证实区间内具有合适的准确性、精密度、线性⑾耐用性(Robustness)：分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变时，测量能力保持不受影响，可用于说明正常使用时的可靠性。10、阐述定量限与检测限的定义及区别、表示方法。定量限：是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其结果应具有一定的准确度和精密度。检测限：是指分析方法在规定的实验条件下试样中被测物能够被检测出的最低量。区别在于：定量限所规定的最低浓度应满足一定的精密度和准确度的要求。定量限：信噪比3:1检测限：信噪比10:111、比较比色法、紫外法、荧光法的异同点。同：都是属于光谱分析法，操作简便、快速。定量方法采用标准曲线法和标准对照法。异：比色法、紫外法灵敏性和选择性较差，直接紫外法需经过萃取、纯化等措施，才能得到较好的分析结果。比色法要用显色剂，紫外法要求物质有共轭双键，能对紫外吸收。紫外法是对吸收光进行检测，荧光是对发射光进行检测。荧光法有较高的灵敏性，专属性也较强。药物必须有一定化学结构才能产生。12、紫外法消除干扰的方法有哪些？说明原理和应用条件。①差示分光光度法原理：利用被测物在两种不同溶液中吸收光谱发生了特征性变化，而共存干扰物在该两种溶液中未引起光谱变化，测定两种溶液的吸收度差值（ΔA值），根据ΔA与被测物浓度C的线性关系进行定量测定。应用条件：应用差示光谱法时，必须使被测物在两种溶液中以不同的化学形式存在，且两种化学形式的吸收光谱应有显著差异。②双波长法应用：本法主要用于二元混合物或浑浊样品的测定。选择两个合适的波长，一个为测定波长λ测，另一个为参比波长λ参，测定两波长处吸收度差ΔA=λ测-λ参，根据ΔA与浓度C的线性关系进行定量测定。原理：消除干扰的原理在测处：A测=A样＋A杂在参处：A参=A’样＋A’杂⊿A=A测—A参=