搜索
离子交换层析柱和填料选择指南GE医疗中国GE梦想启动未来一般信息离子交换层析的原理离子交换（IEX）层析能够分离电荷只有轻微差别的一分子或组分子。以保证分离是基于带电分子与带相反电荷的层析填料之间的可逆相互作用。通常情况下，选择条件被感兴趣的分子随着上样柱上而结合到层析填料然后改变条件以便使被结合的物质被洗脱。经常通过连续梯度或逐步增加离子强度进行洗脱，最常使用NaCl。图1显示典型的高分辨率梯度洗脱。阶段洗脱如图3所示。]lCaN[柱体积（CV）01M5CV不结合的分子在梯度开始前被洗脱高盐洗涤平衡梯度洗脱样品上样体积再平衡洗涤5–10CV5–10CV10–20CV紧密结合的分子在高盐洗涤中被洗脱图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的pH，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。图2显示如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数之一）。离子交换剂的选择以强交换剂(Q,S,SP)开始，能够在广泛的pH范围进行开发工作。如果感兴趣蛋白的等电点低于pH7.0或未知，则使用强阴交换剂（Q）结合蛋白。当在一个极端pH下出现最大分辨率，而且感兴趣的蛋白质在此pH下稳定时，使用强交换剂。如果强的离子交换剂的选择性不理想，则考虑使用弱的交换剂(DEAE,ANX,CM)，但请记住弱的离子交换剂的离子交换能力随着pH而变化。多峰配体(MMC,adhere)提供离子相互作用、氢键和疏水相互作用。MMC表现的如同弱的阳离子交换剂，但可以在高电导率下结合。Adhere表现为强阴离子交换剂。层析柱填料选择根据纯化步骤的目标和起始材料的条件选择离子交换填料。其他因素例如样品稳定性、规模、速度、结合能力和提供的设备也可能影响最后的选择。一般信息选择性和缓冲液pH图2显示pH对选择性的影响。三种假定蛋白在不同pH下的分离如下所述，在图中阐明四种情景（见编号的箭头）。酸性最强pH：所有三种蛋白都处于它们的等电点，带正电荷，且只结合阳离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱下来。较小酸性pH：蓝色的蛋白在其等电点以上，带负电荷，而其他蛋白仍然带正电荷。蓝色蛋白结合阴离子交换剂，并可以与直接洗涤穿透的其他蛋白分离。另外，红色和绿色蛋白可以在阳离子交换剂上被分离，而蓝色蛋白洗涤穿透。碱性最强pH：所有三种蛋白都高于它们的等电点，带负电荷，且只结合阴离子交换剂。蛋白质按照它们的净电荷顺序被洗脱。较小碱性pH：红色蛋白低于其等电点，带正电荷。红色蛋白结合阳离子交换剂，而其他蛋白洗涤穿透。另外，蓝色和绿色蛋白可以在阴离子交换剂上进行分离，而红色蛋白洗涤穿透。VVVAbsAbsAbsAbsVVVVVAbsAbsAbsAbspH+0–阳离子阴离子1324图2.pH对选择性的影响（洗脱模式）。表面净电荷样品制备为了获得最佳的分离并避免层析柱性能的退化，正确的样品制备是必要的。样本必须是澄清的，无颗粒物质。为了去除颗粒物质，过滤（过滤器孔径见缓冲液配制）或离心（10000g，15分钟）样品。脱盐样品使用HiTrap™Desalting5ml（体积达到1.5ml）或HiPrep™26/10Desalting（体积达到15ml）转换为所选择的其实缓冲液。在高盐浓度下不含主要污染的非常小体积的样品可以用起始缓冲液稀释，以降低盐浓度到不干扰填料的水平结合。层析柱准备在使用任何IEX填料前洗掉保存溶液和防腐剂。使用预装层析柱以保证最好的性能分离效果和可重复的结果所需要的填充床体积是由待纯化样品的量和填料的结合容量决定。装柱，层析柱将具有超过所需要结合容量大约5倍的结合容量，柱床高度达到20cm。缓冲液配制有关挥发性和非挥发性缓冲系统的建议见表1。缓冲离子应该具有与IEX填料上功能基团相同的电荷，pKa值在工作pH的0.6pH内。使用的缓冲液浓度足以维持缓冲能力和恒定的pH，一般为20–50mM。在所有盐和添加剂被加入后过滤缓冲液，并始终使用高质量的水和化学试剂。对于颗粒大小90μm使用1μm滤膜，对于34μm颗粒使用0.45μm滤膜，或者对于颗粒大小15μm，或当需要无菌或需要极其干净的样品时使用0.22μm滤膜。为了避免气泡产生，确保层析柱和缓冲液在相同温度下。对于具有未知电荷性质的样品，请尝试下列条件：-阴离子交换（Q）起始缓冲液：pH8.0洗脱缓冲液：含有1MNaCl的起始缓冲液，pH8.0-阳离子交换（S或SP）起始缓冲液：pH6.0洗脱缓冲液：含有1MNaCl的起始缓冲液，pH6.0方法开发与优化（按照优先顺序）通过测试一系列PH值寻找最佳PH，在这些PH值中感兴趣的蛋白质是稳定的。如果目标蛋白的等电点已知，则以更窄的pH范围开始，例如可以从离等电点0.5–1pH单位。如果需要，使用自动化填料搜索程序搜索最佳选择性（测试强或弱的交换剂）。搜索在选定pH下提供合格分辨率的最陡梯度。搜索保持分辨率和尽可能减少分离时间的最高流速。检查对于待定填料的推荐流速。搜索可以上样同时维持满意的分辨率的最大上样量。通常，上样2030%层析柱总结合容量提供采用梯度洗脱的最佳分辨率。6.对于大规模纯化，通过转变为图3所示的阶段洗脱可以减少分离时间和缓冲液消耗。5–10CV5–10CV]lCaN[层析柱体积（CV）平衡再平衡样品进样体积不结合分子洗脱不要的物质洗脱目标分子洗脱紧密结合的分子洗脱高盐洗涤01M图3.使用阶段洗脱的典型IEX分离层析柱清洗样品和缓冲液的正确制备和每次分离结束时高盐洗涤的应用应该能够保持大多数层析柱在良好的条件。然而，性能降低、流速变慢、背压增加或完全堵塞都是填料需要被更严格的条件清洗以去除污染物的种种表现。建议在层析柱清洗期间逆向流动，以便使污染物不需要通过整根层析柱。对于每个清洗步骤所需要的柱体积数和时间根据污染程度而变化。如果去除普通污染物的清洗程序不能恢复层析柱的性能，则在尝试另一种清洗方法前先更换顶部过滤器（如果可能）。当更换过滤器时要小心，因为这可能影响柱装填和干扰性能。注释：有关推荐流速，请参考表格“离子交换产品”。常见污染物的去除下列程序对于去除常见污染物是令人满意的：用至少2个柱体积（CV）的2MNaCl洗涤。用至少4CV的1MNaOH洗涤（流速与步骤1相同）。用至少2CV的2MNaOH洗涤（流速与步骤1相同）。用至少2CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同），直到紫外基线和洗脱pH稳定。用至少4CV的起始缓冲液或储存缓冲液洗涤（流速与步骤1相同），直到pH和电导率达到所需要的值。沉淀蛋白的去除注入1CV的胃蛋白酶（1mg/ml，在0.5MNaCl,0.1M乙酸中）。在室温下保持过夜，或在37℃保持1小时。用至少2CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗脱pH稳定。用至少4CV的起始缓冲液或储存缓冲液洗涤，流速与步骤2相同，直到pH和电导率达到所需要的值。替代程序用2CV的6M盐酸胍洗涤。马上用5CVpH7–8的缓冲液洗涤。用至少2CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤2相同），直到紫外基线和洗脱pH稳定。用至少4CV的起始缓冲液或储存缓冲液洗涤，流速与步骤2相同，直到pH和电导率达到所需要的值。脂类、疏水结合蛋白或脂蛋白的去除可能需要有机溶剂或去垢剂以完全去除这一类型污染物。在使用有机溶剂前，用至少4CV的蒸馏水洗涤以避免任何盐沉淀在层析柱上。当加入有机溶剂或溶液时，可能有必要减少流速以避免层析柱压力过高。使用清洗溶液如高达100%的异丙醇、100%的甲醇、100%的乙腈、2MNaOH、75%的乙酸、100%的乙醇、离子或非离子型去垢剂。请务必检查说明书中提供的溶剂与填料或层析柱的兼容性。避免阴离子去垢剂与Q、DEAE和ANX带电基团一起使用。避免阳离子去垢剂与S、SP和CM带电基团一起使用。清洗程序，方案1用4CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。用至少2CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗脱pH稳定。立即用3CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相同）。清洗程序，方案2用2CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1M乙酸）。用5CV70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。用至少2CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同），直到紫外基线和洗脱pH稳定。用3CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。技术信息表1.非挥发性和挥发性缓冲系统用于阴离子交换层析的缓冲液pH间隔4.3-5.34.8-5.85.5-6.56.0-7.06.2-7.28.6-9.67.3-8.37.6-8.68.0-9.08.0-9.08.4-9.48.4-9.49.0-10.09.2-10.210.0-11.010.6-11.6物质N-甲基哌嗪哌嗪L-组氨酸Bis-TrisBis-Tris丙烷Bis-Tris丙烷三羟乙基胺TrisN-甲基二乙醇胺N-甲基二乙醇胺二乙醇胺丙烷1,3二氨基乙醇胺哌嗪丙烷1,3二氨基哌嗪浓度（mM）20202020202020202050pH8.4时为20pH8.8时为502020202020反离子Cl-Cl-或HCOOCl-Cl-Cl-Cl-Cl-或HCOOCl-SO42-Cl-或CH3COOCl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-pKa(25°C)14.755.336.046.486.659.107.768.078.528.528.888.889.509.7310.5511.121参考文献:CRC化学与物理手册第83版，2002-2003年。用于阳离子交换层析的缓冲液pH间隔1.4-2.42.6-3.62.6-3.63.3-4.33.3-4.33.7-4.75.1-6.14.3-5.35.2-6.25.6-6.56.7-7.77.0-8.07.8-8.8物质马来酸甲基马来酸柠檬酸乳酸甲酸琥珀酸琥珀酸乙酸甲基马来酸MES磷酸盐HEPESBICINE浓度（mM）20202050505050505050505050反离子Na+Na+或Li+Na+Na+Na+或Li+Na+Na+Na+或Li+Na+或Li+Na+或Li+Na+Na+或Li+Na+pKa(25°C)11.923.073.133.863.754.215.644.755.766.277.207.568.331参考文献:CRC化学与物理手册第83版，2002-2003年。挥发性缓冲系统pH间隔3.3-4.33.3-4.3;4.8-5.83.3-4.3;9.3-10.34.3-5.84.3-5.3;9.3-10.33.3-4.3;8.8-9.84.3-5.3;8.8-9.85.9-6.9;9.3-10.35.9-6.9;8.8-9.85.9-6.9;8.8-9.85.9-6.9;8.8-9.84.3-5.3;7.2-8.2缓冲系统甲酸嘧啶/甲酸三甲胺/甲酸嘧啶/乙酸三甲胺/乙酸氨水/甲酸氨水/乙酸三甲胺/碳酸盐碳酸氢铵碳酸铵/氨水碳酸铵N-乙基吗啉/醋酸盐反离子H+HCOO-HCOO-CH3COO-CH3COO-HCOO-CH3COO-CO32-HCO3-CO32-CO32-HCOO-对于缓冲离子的pKa值13.753.75;5.254.75;9.814.75;5.254.75;9.813.75;9.254.75;9.256.35;9.816.35;9.256.35;9.256.35;9.254.75;7.721参考文献:CRC化学与物理手册第83版，2002-2003年。ÄKTAdesign™层析系统为每种pH和填料提供关于缓冲液配方的建议。在所选择系统中提供的BufferPrep功能自动补偿盐浓度和温度变化引起的pH变化，确保整个分离过程中pH值一致。精细纯化去除微量杂质或密切相关的物质样品条件：几乎为纯的中间纯化去除杂质样品条件：部分纯化捕获分离、浓缩和稳定目蛋白样品条件：澄清或非澄清昀高分辨率μg/轮