高效毛细管电泳(WY)

高效毛细管电泳CapillaryElectrophoresis,CE2电泳在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；3经典电泳利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率较低。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。4毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。采用了0.05mm内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。5高效毛细管电泳高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了25-100μm内径的毛细管；采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。毛细管电泳的柱效远高于HPLC，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。6与传统的电泳相比，毛细管电泳的主要特点：一、操作简便，可以自动化二、高效，可以达到非常高的分离效率三、快速，可以在毛细管两端加上高至30kV的高电压四、低耗，毛细管内径很小五、廉价六、毛细管电泳分离模式多样，功能强大，可以用于药物分析、药代动力学研究、手性分离及蛋白质、核酸分离、环境监测；七、与高效液相色谱相比，毛细管电泳具有相当的抗脏能力7基本概念毛细管总长度(L,cm)毛细管有效长度(l,cm)毛细管的入口端到检测窗口的距离；迁移时间(t,min)带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；电泳速度（vcm/s）在单位时间内，带电粒子定向移动的距离；电场强度(E,V/cm)电压/毛细管总长度；电泳淌度（μcm2/(V·s)）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；89检测窗10第22章毛细管电泳22－1毛细管电泳的原理1装置毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液高压电源（可高至30KV）主要构件均为：毛细管、高压电源、在线检测器、进样系统、数据采集处理系统以及计算机等。11121.高压电源（1）0～30kV稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：输出电压稳定在±0.1%以内（5）电源极性易转换，反向电压也是电泳分析时常常需要的。132.缓冲液池1、化学惰性，不与样品发生破坏性作用；2、不影响凝胶的寿命；3、紫外吸收弱、电导率低；4、缓冲容量尽可能大；5、在空气中稳定。143.毛细管毛细管是毛细管电泳的核心部件。材料要求：毛细管柱的材料应是化学和电惰性的，紫外光和可见光均可以通过，有一定的柔韧性，易于弯曲，耐用且便宜。目前，主要采用的材料是聚四氟乙烯、石英和玻璃聚四氟乙烯：电渗流可控制；散热差，对短波紫外光有较强吸收玻璃：电渗强、紫外吸收强、机械性能差；石英：它具有表面的金属杂质含量低，有电渗，吸附少等优点，各项性能好。153.毛细管管径：目前毛细管的管径为25～100μm，小管径毛细管具有以下优点：首先是减小电流，从而减少自热。在同样电压下，管径越小，电流也就越小，产生的焦耳热也就越少；再者，管径小，散热效果好。管径越小，表面积/体积比越大，散热效果越好。缺点：管径减小，表面积/体积比增大，不利于抑制吸附作用管径小还会导致上样、清洗困难，使光程缩短，检测灵敏度降低。因此，毛细管管径的下限受检测灵敏度的限制，其通常所使用的管径为25～100μm，常用的为50μm和75μm。163.毛细管管长在理想条件下，如果电场强度保持恒定，则分离度随着管长的增加而增加。为了保持电场强度的恒定，在增加管长的同时还必须相应地增加操作电压。由于实际上电压的取值有一个极限，不能无限增大，因此，管长也不能无限增加。通常长度=1m。173.毛细管添加剂聚乙烯醇改性管壁可完全抑制电渗，防止高极性的，特别是碱性蛋白质粘附；用带羟基的，特别是可电离的碱性聚合物改性，可使电渗流较减少，甚至可以倒向，适于小的阴离子的快选择分离；固载化的改性处理用于分离核苷酸。184.柱恒温系统毛细管电泳操作中柱温的影响包括两个方面:一是焦耳热上升,导致峰形、柱效及分离度恶化二是温度波动导致分析结果重现性差毛细管的温控方式一般有气体、液体和固体控温三种,其装置的复杂程度依次加大,但控温效果也依次提高。191、气冷恒温通常指通过空调控制环境温度或是在分离室内用风扇等来达到强制对流散热效果，加速毛细管外壁的热交换，从而实现温度控制。气冷控温系统容易实现，不影响分离操作，但控温效果不是十分理想。2、液冷恒温将毛细管置于一恒温液体中，能实现比较精确的温度控制。一般选用水、煤油或是氟代烷烃等作为冷却介质。冷却介质一般由专门的制冷系统冷却或恒温，通过一定的路径进行循环。液冷控温方法对毛细管和仪器设计的要求比较高，需要系统有很好的密封性、电绝缘性和安全保护设计。3、固体温控这种固体恒温方式，通常采用热传导系数较高的合金材料制成帕尔帖电热控制器，能迅速地发散焦耳热。与前两种控温方法相比，这种方式的控温效果要更好，且也更稳定。205.检测器要求：具有极高灵敏度，可柱端检测；为了解决因毛细管直径极小，而导致的检测光路短，上样量低的问题，毛细管电泳中通常采用在线检测；检测器位于距进样端约毛细管总长的2/3~4/5处。检测器、数据采集与计算机数据处理一体化。类型检测限/mol特点紫外-可见10-13～10-15通用性好，灵敏度偏低荧光10-15～10-17灵敏度高，样品需衍生激光诱导荧光10-18～10-20灵敏度极高，样品需衍生安培法10-9～10-10灵敏度偏低，操作方便216.数据采集系统毛细管电泳的数据记录、谱图形式和数据处理方法，与色谱相似。可以采用记录仪、积分仪、计算机等不同的手段和方法对电泳图谱进行记录和分析、处理。一系列软件具有谱图处理和定量计算的功能，可以自动判峰，并为这些峰确立恰当的基线，及为重叠峰确立恰当的分割线，软件还允许手动判峰，并在判峰完成后，直接获得谱图中所检测到的峰的出峰位置、峰面积、峰高及半峰宽等相关信息。22232425264.2电渗流1.电渗流现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。272.HPCE中的电渗现象与电渗流◘用作毛细管材料的熔融石英的等电点为1.5左右，因此在常用缓冲液pH下，表面电离成硅羟基（-SiO-）,管内壁带负电荷，形成双电层。◘在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，称为电渗流。283.HPCE中电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；（2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。294.HPCE中电渗流的流形毛细管电泳中电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型（引起谱带展宽较大）。305.HPCE中电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。31326.HPCE中影响电渗流的因素1.电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2.毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；333.电解质溶液pH的影响缓冲液的pH影响管壁基团的解离度，对石英毛细管而言，在pH2.5时硅羟基基本不解离，电渗流接近于零；当pH10时，硅羟基基本完全解离，电渗流的变化很小；在pH处于4～10之间时，硅羟基的解离度随pH的上升而迅速增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。344.温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大，分析时间减短，分析效率提高。温度变化来自于“焦耳热”焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；温度每变化1℃，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%但温度过高，会引起毛细管柱内径向温差增大，焦耳热效应增强，柱效降低，分离效率也会降低。355.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂，如甲醇、乙腈，使电渗流增大。364.3分离类型介绍常用的几种；根据试样性质不同，采用不同的分离类型；37一、毛细管区带电泳capillaryzoneelectrophoresis，CZE带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；38二、毛细管凝胶电泳capillarygelelectrophoresis，CGE将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。39三、胶束电动毛细管色谱micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。胶束作为一个可移动的固定相（准固定相）402.电泳流和电渗流的方向