第三章-毛细管电泳分离技术-2015

第三章毛细管电泳分离技术第一节概述•电泳是基于两种或多种带电粒子或微粒，它们所在的介质受到外加直流电场的作用下，其迁移速率不同而得到分离的一类方法。（electrophoresis）发展历程•1807年，FerdinandFredericReuss就观察到了荷电物质在电场力作用下会发生运动的现象。•1909年，由Michaelis对此现象的描述中提出电泳这个术语(elektron和pbore,分别代表电和搬运者的意思)•1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白，电泳技术才得到有实际意义的发展，Tiseluis也因此获得了1948年度的诺贝尔奖。•到20世纪50年代，电泳已经是一种与纸和薄层的平面色谱技术一样的实验室常用技术。20世纪70年代在HPLC的推动下，电泳分离技术成为了一种“灰姑娘”式的技术。1981年，Jorgenson等[1]介绍了毛细管区带电泳技术。•1984年Terabe等提出的胶束电动毛细管色谱。•1987年，Hjerten建立了毛细管等电聚焦。•1987年，由Chohen等提出了毛细管凝胶电泳。•1991年，Monnig等[2]首次提出了高速毛细管电泳。•目前，毛细管电泳已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质和核酸等离子型生物大分子的分离分析，加入表面活性剂还可以扩大到中性粒子，甚至应用到细胞和病毒等的分离。同时，在小分子化合物的分离分析方面也取得了重大进展。第二节毛细管电泳基本原理•一、毛细管电泳的理论基础•在毛细管电泳中带电粒子所受的驱动力：电泳力和电渗力。•电泳和电渗是毛细管电泳分离理论中最基本的概念。（一）电泳和电渗•电泳(Electrophoresis)是指溶液中带电粒子(离子、胶团)在电场中定向移动的现象。•电泳是驱动电解质运动的第一种动力，如此形成的粒子移动简称为泳流•电泳迁移速度ve:ve=μeE=μeV/L•μe:电泳迁移率(电泳淌度);E:电场强度;V－毛细管柱两端施加的电压；L－毛细管柱的长度。•被分离组分在毛细管中的运行时间t（p86有误）VLlvleetl－为毛细管柱从进样端至检测窗口的距离(有效长度)•电泳迁移率μe•μe=νe/E=Q/f•当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲溶液的粘度及带电离子的大小有关。LRQVLVfQesv6Q－离子所带的净电荷；f－Stokes阻力系数。η是缓冲溶液的粘度(动力学的)，Rs是离子的有效半径(包括溶剂化层)•电渗(Electroosmosis)是驱动电解质运动的第二种作用力，它使毛细管中的溶剂在直流电场作用下发生定向运动。电渗流的产生•毛细管内壁表面上的硅醇基在pH3的水溶液中，可电离而产生SiO-负离子，使毛细管内壁带上负电荷，因此，溶液中的一部分正离子(如H+离子)就靠静电作用而吸附于毛细管内壁上，形成一个双电层(Electricdoublelayer)。其中一层是带负电的内壁，一层是带正电的溶液离子吸附层。但溶液中的其余大部分正离子则是离内壁越远，越呈自由状态，于是在吸附层之外又存在着一个扩散层。•固、液两相之间的相对运动发生在吸附层与扩散层之间的滑动面上，此处的电动势称为界面电动势，也称ζ电位。•由于处在扩散层中的正离子的溶剂化作用，它在电场中发生迁移时，将带动整个溶液向阴极移动，所以就形成电渗流。•电渗流速度Veo与ζ电位、ε、E成正比，而与介质的粘度η成反比。•与HPLC柱不同，毛细管中的电渗流呈平面流型，它不存在径向梯度。4eo4eoEeoEv•电解质区带的移动速度(Vi)等于电解质区带的电泳迁移速度(Ve)与溶剂流速度(Veo)之和。Vi=Ve+Veo•当把样品从阳极端注入毛细管时，假设A物质为负离子，B物质为正离子，则带不同电荷的离子将按下面的速度迁移到阴极，到时间t时，A、B物质已经分离了。•正离子：νt=νeo+ν+•中性分子：νt=νeo•负离子：νt=νeo-νˉ注：电渗流的速度为泳流的若干倍•抑制毛细管中电渗流的办法：•消除固液界面间的ζ电位或提高溶液的粘度；•在毛细管的内壁涂上聚合物，如聚丙烯酰胺涂层。电渗流的速度为泳流的若干倍，且受pH等条件的影响很大，在分离过程中很容易发生变化，因而必须加以控制，使其在一定范围内保持恒定。(二)分离速率•如果溶质纵向扩散是区带展宽的唯一因素，对于CE来说，可以通过增大分离电压和缩短毛细管长度来提高速度，同时兼顾分离效率•在任何给定的时间内要获得最高的理论塔板数，分离电压与毛细管长度的比例应该最大，也就是说在只考虑溶质纵向扩散的前提下，采用尽可能高的分离电压和短的毛细管，可以实现高柱效和快速分离。高的电渗流同样可以提高分析速度和柱效。222LVDtNappmigtmig－组分的迁移时间,μapp－表观电泳迁移率；N－理论塔板数；D－溶质的扩散系数影响柱效的因素•实际上，分离电压增大和毛细管长度缩短时，除了扩散外，还有诸多因素影响柱效，其中最严重的是温度效应，即毛细管的焦耳热问题•毛细管在高电压场下产生的焦耳热G•G=κ·(V/L)2·πr2•κ－电导率；r－毛细管内径•焦耳热随着分离电压增大和毛细管的缩短而增大。焦耳热过大会造成峰扩展、变形。•补救措施：•采用小内径毛细管可以降低焦耳热。•采用低电导率的缓冲溶液。如具有高的相对分子质量、小电荷的溶液或窄pH范围的两性电解质。•要在维持高效情况下加快CE的分离速度，可以采用以下几种方法：•①短而窄内径的分离毛细管；•②高分离电压；•③高电渗流。•另外，对于带负电荷的分离物，通常在缓冲溶液中加入阳离子表面活性剂，通过改变EOF的方向来提高分离速度。(三)分离效率和分辨率•毛细管电泳分离柱效方程式LlDVLlDVDtleoeappN2222提高分离电压是增加分离效率的主要途径，在相同的操作电压下，l/L=1，分离效率最高。此外，N与溶质的扩散系数D成反比，所以用毛细管电泳分离大分子时，可得到高的柱效。（Giddings的色谱柱效理论，Einstein扩散定律）•毛细管电泳的分辨率（Giddings）5.0215.0241eoiDVR提高毛细管电泳的分辨率有两条途径：一是通过增大分离电压来提高柱效;二是控制电渗流，当电渗流移动方向与分离组分的迁移方向相反，而速度大小相等时，分辨率将趋于无穷大。（四）影响分辨率的因素•1.毛细管电泳中的电解效应及缓冲溶液的选择。•2.电压的影响。•3.黏度。•4.区域的畸变1.电解效应及缓冲溶液的选择•在毛细管电泳中，阳、阴两极最有可能发生的电极反应，其结果是阳极端因OH-被消耗而H+量相对增加，阴极端则因消耗H+而使OH-量相对增加。两极溶液的pH差距变大•电渗流则受溶液的pH影响很大。•所以，选择具有pH缓冲能力的溶液为分离介质•当缓冲液浓度(或离子强度)增加时，双电层的厚度降低，Zeta电位减小，溶液的粘度增大，电渗流速度将减小。减小电渗流会增加分辨率。过高浓度的电解质容易导致溶液过热，会引起电泳区带展宽，使分辨率降低。（适度的浓度）•所用缓冲溶液的种类也会影响电渗流（磷酸盐溶液）2.电压的影响•施加的分离电压越高，分辨率越大。•根据欧姆定律，电压与电流呈线性关系，在熔凝毛细管中产生的热量与电流的平方成正比，焦尔热•电流的产生与缓冲溶液的阴离子种类有关，应选用相同电压下电流小的阴离子制备缓冲溶液。3.黏度•在凝胶电泳中温度的增加可改变媒介的黏度。4.区域的畸变•在一个电泳泳动期间，特别在凝胶柱上，如冷却不充分，凝胶较暖部分的迁移带的移动速度会比那些较冷的部分快。这个迁移速度的差异产生了弯曲带。•这个可以导致相邻区的重叠和差的分辨率。（五）影响电泳淌度的因素•1.带电分子的本质•2.电泳系统的性质•（1）电泳缓冲液的离子构成•（2）温度•（3）电泳缓冲液的pH值•（4）操作电压•（5）载体介质的选择，1.带电分子的本质•微粒的净电荷、大小、形状和相对质量对它们的电泳淌度有相当大的影响。•分子的带电量与大小的比例是一个重要的参数。•电量与大小的比例（e/r）越大，分子在给定条件下，迁移得越快。2.电泳系统的性质•电泳缓冲液的离子构成、温度、电泳缓冲液的pH值、操作电压、载体介质的选择（1）电泳缓冲液的离子构成•由于带电分子表面的可电离层和电泳缓冲液中离子间的相互作用，一个带电分子被反电荷的离子团所包围。结果，它的净电荷和电泳淌度都下降了。•选择一个合适的盐浓度显得很必要。（2）温度•温度对电泳有显著的影响。•在一个电泳泳动期间，热量（焦耳热）会产生并且在很多途径上影响着电泳扩散。•温度增加引起带电分子迁移带的扩散增加，如果电泳持续时间长（数小时）扩散作用变得更显著。•温度引起蒸发作用•温度引起对流现象•为一次电泳泳动选择一个最佳温度并在整个分析过程中都维持着是必要的。（3）电泳缓冲液的pH值•pH对一个蛋白质分子上的净电荷有明显的作用。•为了优化（蛋白质）分子混合物的分离，pH值的选择应以净分子电荷为基础。•例如，在一个电泳泳动期间，两个或更多的蛋白质一起迁移而只形成一条区带。如果我们在不同的pH值下进行分析，将导致多余蛋白质带的出现，促使样品中其它蛋白质的分离。（4）操作电压•一个分子的迁移速率和媒介两边的场强是成比例的。•但是，随着电压的增大对流也上升，导致更强大功率的产生（功率以对流平方的方式增加），这样一些功率以热量形式消散。•电压（或对流）应该要足够大以允许带电分子的快速迁移，但也不能太大以产生过量的热。（5）载体介质•选择最合适的载体介质以下面几点为依据：•样品质量•分子的大小•如果不得不使用筛分凝胶时，它的毛孔大小（集中性）也应该要选择以适合所研究的分子大小、分析所需时间。二、毛细管电泳的分离模式•毛细管区带电泳(CZE)•胶束电动毛细管电泳(MECC)•毛细管凝胶电泳(CGE)•毛细管等电聚焦(CIEF)•毛细管等速电泳(CITP)•毛细管离子电泳(CIE)•毛细管电色谱•毛细管阵列电泳•亲和毛细管电泳第三节毛细管电泳装置•直流高压电源、毛细管、进样装置、检测器和记录仪等•高压电源可对毛细管施加5~50kV电压，操作电压一般控制在5~30kV范围。•CE通常使用内径10~100μm、长12~120cm(内涂聚酰亚胺)弹性融凝石英毛细管，毛细管的两端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中，毛细管内也充满同样的缓冲溶液。•被分离试样可以采用重力法、抽真空法或电迁移法等多种进样方式由毛细管一端进入。一、毛细管电泳的进样技术•（一）直接在线进样•（二）近端进样及双向进样•（三）流动注射与毛细管电泳联用(FI-CE)•（四）液相色谱与毛细管电泳联用•（五）光学门进样•（六）流动门进样光学门进样装置示意图流动门进样装置示意图二、毛细管电泳检测器•由于样品区带在高压电场作用下，迁移速度较快，因此，CE要求所用的检测器必须具有很快的响应速度和很高的灵敏度。•光学检测器•电化学检测器•质谱检测器•核磁共振检测器检测器类型检测限/mol·L-1紫外检测普通10-6~10-4轴向照射10-8~10-6二极管阵列或多波长扫描10-6~10-4荧光检测普通灯10-8~10-5激光诱导荧光10-9~10-7二极管陈列10-7~10-5电荷耦合器件10-12~10-9质谱检测10-9~10-5电化学检测电导10-8~10-7安培10-9~10-7激光类检测激光热透镜10-8~10-5激光诱导毛细管振动10-7激光拉曼10-7~10-5其他化学发光检测10-9折射率检测10-7~10-5同位素检测10-9~10-7第四节毛细管电泳技术的应用研究进展表3-3毛细管电泳技术的特点类别特点速度快速，可于几分钟内完成复杂成分的分离分辨率带展宽有限，分辨率高灵敏性检测下限低，灵敏性高进样体积进样体积小，毫微升检测方式可使用多种检测器自动化方面自动化程度高，进样、