硅藻的培养

硅藻的培养王提峰----2013.10.28硅藻简介硅藻门（Bacillariophyta）有100,000多种，可分为2纲，中心硅藻纲和羽纹硅藻纲。植物体单细胞，或由细胞彼此连接成链状、带状、丛状、放射状的群体，浮游或着生。二分裂繁殖形成两个细胞，一个与母细胞大小相等，一个则比母细胞小。这样连续分裂的结果，个体将越来越小。为种群延续，硅藻有特殊的产生复大孢子的繁殖过程。还有有性繁殖。常用培养方式分批培养(batchculture)在一个相对独立密闭的系统中，一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养(batchculture)。由于它的培养系统的相对密闭性，故分批培养也叫密闭培养(closedculture)。分批培养特点：1）操作简单。培养系统属于封闭式，培养过程中除了控制温度和光强外，不进行其他任何控制。2）直观反映细胞生长代谢的过程。分批培养中，细胞的生长分为4个阶段：迟缓期,对数期、稳定期及衰亡期。3）培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。常用培养方式半连续式培养(semi-continuousculture)半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补充，使维持细胞浓度恒定或培养液总体积不变。半连续培养特点：1）细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。2）可进行多次收获。常用培养基的配置QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLNaNO375g/LdH2O8.83x10-4M1mLNaH2PO4·H2O5g/LdH2O3.63x10-5M1mL*Na2SiO3·9H2O*30g/LdH2O*1.07x10-4M*1mLf/2tracemetalsolution(seerecipebelow)-0.5mLf/2vitaminsolution(seerecipebelow)-f/2Medium(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)向950mL过滤海水中加入下列物质：加过滤海水直到最终体积为1L，高压灭菌。注意：高压灭菌事会产生大量的硅沉淀，因此，当藻类不需要硅时可以不添加硅元素。常用培养基的配置f/2TraceMetalSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)向950mL蒸馏水中加入下列物质:QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M4.36gNa2EDTA·2H2O-1x10-5M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O4x10-8M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O3x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O8x10-8M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O5x10-8M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O9x10-7M加蒸馏水至最终体积为1L，高压灭菌。常用培养基的配置f/2VitaminSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)向950mL蒸馏水中加入下列物质：QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLVitaminB12(cyanocobalamin)1.0g/LdH2O1x10-10M10mLBiotin0.1g/LdH2O2x10-9M200mgThiamine·HCl-3x10-7M加蒸馏水至最终体积为1L，4℃保存。注意：因为维生素B12和生物素是以结晶形式存在，因此在配制母液的时候，1mg维生素B12只需加0.89mLdH2O，1mg生物素只需加9.6mLdH2O。常用培养基的配置QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLNaNO375g/LdH2O8.83x10-4M1mLNH4Cl2.68g/LdH2O3.63x10-5M1mLbeta-glycerophosphate2.16g/LdH2O1x10-5M1mL*Na2SiO3·9H2O*30g/LdH2O*1.07x10-4M*1mLH2SeO31.29mg/LdH2O1x10-8M1mLTris-base(pH7.2)121.1g/LdH2O1x10-3M1mLKtracemetalsolution(seerecipebelow)-0.5mLf/2vitaminsolution(seerecipebelow)-KMedium(Kelleretal.1987)向950mL过滤海水中加入下列物质：加过滤海水直到最终体积为1L，高压灭菌。注意：高压灭菌事会产生大量的硅沉淀，因此，当藻类不需要硅时可以不添加硅元素。常用培养基的配置KTraceMetalSolution(Kelleretal.1987)向900mL蒸馏水中加入下列物质:QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium41.6gNa2EDTA·2H2O-1x10-4M3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O1x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O1x10-9M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O1x10-9M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O1x10-8M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O1x10-8M加蒸馏水至最终体积为1L，高压灭菌。实验室常用硅藻培养三角褐指藻Phaeodactyluntricornutum威氏海链藻Thalassiosiraweissflogii假微型海链藻Thalassiosirapseudonana中肋骨条藻Skeletonemacostatum注意事项培养在适宜的温度、盐度、光照条件以及光周期下。不同培养目的采用不同的培养方法，封闭培养或是半连续培养。不同研究目的选择不同培养基以及控制培养基添加比例。对于特殊要求添加特殊培养基。关于细胞计数。单种培养和混合培养。注意事项细胞计数不论是封闭培养还是半连续培养，研究过程中都需要对藻液进行细胞计数以观察其生长。计数方法有显微计数和仪器计数。显微计数要求藻液浓度较高，藻液浓度低时计数误差较大。仪器计数有多种仪器可以选择，流式细胞仪，颗粒计数仪等。考虑到硅藻的复大孢子繁殖，使用仪器计数某些硅藻时可能会出现不同程度的偏差。出现不同的峰。此时，选取合适的粒径范围进行计数非常重要。有些种类藻细胞呈链状链结，不能使用仪器计数，只能显微计数(例如Skeletonemacostatum)。注意事项单种培养和混合培养做单种研究时为纯种培养，培养不能混入杂藻以及其他生物。培养基添加以及接种操作都需要在无菌环境下进行。初始接种密度不能太低，根据培养目的可以为100cells/ml左右。做竞争性实验时为混合培养，培养同样不能混入杂藻以及其他生物。需要无菌环境下培养基添加以及接种操作。初始接种浓度以及比例要确定，一般混合培养接种比例计算按照相同生物量，也就是“细胞数⨯细胞体积”相等。作为饵料培养硅藻也常常作为饲养植食性浮游动物的饵料。因此在实验室也可作为饵料培养。作为饵料培养时，一般要求很高的浓度，50万cells/ml以上。所以要求培养基中各营养盐充足，并且在适宜的温度光照下进行。有时候由于培养水质的恶化，藻细胞长不起来，从而影响浮游动物的饲养。这时为满足需要可以进行藻液的浓缩。有些硅藻作为饵料时可能产生毒性物质，这时作为饵料时应特别注意。选取合适的饵料藻非常关键。That’sallThanksforyourattention!