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1第一章流式细胞仪的结构和原理第1节流式细胞术发展史纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前昀多可同时检测15种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中去。流式细胞术的发展简史：1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数；1934年Moldaven是世界上昀早设想使细胞检测自动化的人，他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞数量；1936年Caspersson等引入显微光度术；1940年Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白；1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器；1949年WallaceCoulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利；1950年Caspersson用显微分光光度计的方法在紫外线（UV）和可见光光谱区检测细胞：1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功地设计红细胞光学自动计数器；1953年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置，成为流式细胞仪的雏形；1954年Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器；1959年B型Coulter计数器问世；1965年Kamemtsky等提出两个设想，一是用分光光计定量细胞成份；二是结合测量值对细胞分类；1967年Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法；1969年VanDilla，Fulwyler及其同事们在LosAlamos，NM(即现在的NationalFlowCytometryResourceLabs),发明第一台荧光检测细胞计；1972年Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号；1975年Kochler和Milstein提出了单克隆抗体技术，为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础。从此，大量厂家不断研制生产出各具特色的流式细胞仪，流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。科学家们、仪器制造商们又纷纷将流式细胞仪的研究焦点转向染料的开发、细胞的制备方法和为提高电子信号的处理能力上来。进入21世纪，流式细胞术作为一门生2物检测技术已经日臻完善，成为分析细胞学领域中无可替代的重要工具。第2节流式细胞仪结构和工作原理流式细胞仪（Flowcytometry,FCM）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。从开始设想到第一台仪器问世，科技工作者们进行了不懈的努力，随着各项相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的重要工具。流式细胞仪分为三大类：一类为台式机，临床型，其特点为：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握，见图1-2-1。图1-2-1临床型台式流式细胞仪（左：BDFACSCalibur—2L，4F；右：CoulterEPICSXL/XL-MCL—1L，4F中：Partec，cyFlow—1L,3F）第二类为大型机，科研型，其特点为分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更广泛更灵活的科学研究应用，见图1-2-2、1-2-3。3图1-2-2大型科研型流式细胞仪（左：BD，FACSDiVa—14F，four-sorting；右：CoulterEPICSALTRA—4L,8F；中：Partec，CyFlowSPACE―2L，6F）第三类为新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，昀多检测十三个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数的同时分析。并且可以实现高速分选，速度达到50,000个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。图1-2-3目前昀新型流式细胞仪（左上：partec，CyFlowML―FSC,2xSSC,FL1~FL13；右上：Coulter，CytomicsTMFC500左下：FACSAria，FSC，SSC，FL1-FL13；右下：BD，BDLSR，4L，10F）4（一）流式细胞仪的结构FCM的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。见图1-2-4。图1-2-4流式细胞仪的光路结构1、流动室与液流驱动系统流动室（FlowChamber或FlowCell）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430×180µm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液，鞘液的作用是将样品流环包，鞘液流是一种稳定流动，操作人员无法随意改变其流动的速度，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，使样品流不会脱离液流的轴线方向，并且保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息，见图1-2-5。图1-2-5FCM的流动室和液流系统细胞流和鞘液流的驱动一般采用加正压的方法，流速和压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)PV（勿略高度的变化），可见只要压力恒定，就可得到恒定的鞘液流流速，从而可确保每个细胞流经激光照射区的速度不变。从图1-2-5可以知道，真空泵产生压缩空气，通过鞘液压力调节器加在鞘液上，一恒定的压力（压力的大小由工厂设定），这样鞘液以均速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。而改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。但是，这并不是提高样5本流的速度，而是改变了细胞间的距离，样品流变宽，细胞间距离缩短，这样单位时间内流经光照射区的细胞数就增加。这种情况应在具体实验中引起注意，由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图1-2-5），中心处能量昀高，因此当样本速率选择高速（Hi）时，处在样品流不同位置的细胞或颗粒，受激光光照的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同，这样就会造成测量误差。当在测量分辨率要求高时（如DNA分析）应选取用低速（Low）。2、激光光源与光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光（lightamplificationbystimulatedemissionofradiation,Laser）是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源，这是因为由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1微秒左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜，将其聚焦，形成几何尺寸约为22×66μm即短轴稍大于细胞直径的光斑（见图1-2-6）。这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致，须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处，台式机FCM的光路调节对使用者是封闭的，即安装时由工程师调试完毕后，无需使用者作任何调节，所以使用者操作十分方便。3、光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器（见图1-2-6）。在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-passfilter,LP）、短通滤片（short-passfiltr,SP）及带通滤片（band-passfilter,BP）。（1）长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如LP500滤片，将允许500μm以上的光通过，而500μm以下的光吸收或返回。（2）短通滤片：与长通滤片相反，特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。如SP500滤片，将允许500μm以下的光通过，而500μm以上的光吸收或返回。（3）带通滤片：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500表示其允许通过波长范围为475μm-525μm。图1-2-6流式细胞仪的光学系统64、信号检测与分析系统当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，受激光激发，产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。（1）散射光信号：散射光分为前向角散射（forwardscatter,FSC）和侧向角散射（sidescatter,SSC），散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如染色），因此被称为细胞的物理参数或称固有参数（见图1-2-7）。①前向角散射：前向角散射与被测细胞的大小有关，确切说与细胞直径的平方密切相关，通常在FCM应用中，选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。②侧向角散射：侧向角散射是指与激光束正交90o方向的散射光信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。以上两种信号都是来自激光的原光束，其波长与激光的波长相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。图1-2-7流式细胞仪的散射光图（2）荧光信号：当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量(图1-2-8)。图1-2-8激光的作用原理前向角散射侧向角散射激光FreqFl激光7荧光染料可选用的荧光素多种多样，由于它们分子结构不同，其荧光激发谱与发射谱也各异。选取染料或单抗所标记的荧光素，必须考虑仪器所配置光源的波长。目前台式机FCM常配置的激光器波长为488nm，通常可采用的染料有碘化丙锭(propidiumiodide，PI)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）、PE-CY5等。①荧光信号的线性测量与对数测量荧光信号的线性测量与对数测量主要由电子线路来完成。当携带荧光素的细胞与激光正交时，受激发发出荧光，经过滤光片分离不同波长的光信号分别到达不同的光电倍增管（PMT），PMT将光信号转换成电信号。有些厂家不采用PMT，而采用线性放大光电转换器，其优点是降低成本提高线性度，但其昀大缺点是响应速度慢，造成