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Real-timeqPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手2北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-629517816297940882783852目录目录目录目录前言前言前言前言……………………………………………………………….….………...3一一一一、、、、Real-timeqPCR发展史发展史发展史发展史………………………………………..…….…..3二二二二、、、、Real-timeqPCR概述概述概述概述………………………………………….…………3三三三三、、、、Real-timeqPCR实验设计实验设计实验设计实验设计………………………………………………8四四四四、、、、Real-timeqPCR操作操作操作操作过程过程过程过程…………………………………………….…9五五五五、、、、Real-timeqPCR数据分析数据分析数据分析数据分析…………………………………………...…16六六六六、、、、Real-timeqPCR常见问题分析常见问题分析常见问题分析常见问题分析…………………………..……….……19Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手3北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-629517816297940882783852Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手前言前言前言前言由于由于由于由于Real-timeqPCR的众多优点的众多优点的众多优点的众多优点，，，，现在已经是现在已经是现在已经是现在已经是生命科生命科生命科生命科学领域的一项常规技学领域的一项常规技学领域的一项常规技学领域的一项常规技术术术术。。。。越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验的实验的实验的实验，，，，也基本上被也基本上被也基本上被也基本上被real-timeqPCR所代替所代替所代替所代替。。。。由于由于由于由于real-timeaPCR输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的输出的数据不同于常规的PCR电泳检测电泳检测电泳检测电泳检测，，，，很很很很多没多没多没多没有做过有做过有做过有做过real-timeqPCR的研究者的研究者的研究者的研究者常常常常常常常常感到高深莫测感到高深莫测感到高深莫测感到高深莫测，，，，不知从何入手不知从何入手不知从何入手不知从何入手；；；；甚至一些甚至一些甚至一些甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑感到迷惑感到迷惑感到迷惑，，，，不知所措不知所措不知所措不知所措。。。。本文就从本文就从本文就从本文就从real-timeqPCR的发展史说起的发展史说起的发展史说起的发展史说起，，，，包括包括包括包括real-timeqPCR的原理的原理的原理的原理，，，，实验设计实验设计实验设计实验设计，，，，实际实际实际实际操作操作操作操作（（（（以以以以ABIStepOne仪器仪器仪器仪器，，，，和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例），），），），数数数数据分析据分析据分析据分析，，，，常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面常见问题解答五个方面，，，，手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解手把手教你从各个方面了解real-timeqPCR，，，，彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手彻底的从菜鸟到高手！！！！一一一一、、、、Real-timeqPCR发展史发展史发展史发展史Real-timeqPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-timeqPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在Real-timeqPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman®技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM®StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycleriQ5®、MyiQ®、MJResearchChromo4TMOpticon系列；StratageneMxTM系列；RocheLightCycler®系列；EppendorfMasercycler®；CorbettRotor-GeneTM；CepheidSmartCycler®和BIOER的LineGene系列（考虑到其是日资子公司，还是不并入国内企业吧！）。随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-timePCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。二二二二、、、、Real-timeqPCR概述概述概述概述1.Real-timeqPCR原理原理原理原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手4北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-629517816297940882783852Ct检测。一般来讲，定量PCR仪包括：实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值。（FromInvitrogen）2.Real-timeqPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理也就是说为什么Ct值跟初始模板的量成正比？首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数（具体的后面会讲到）Ct值（Ctvalue），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第3-15个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的是10倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手5北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-629517816297940882783852那么为什么说那么为什么说那么为什么说那么为什么说Ct值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢值跟初始模板的量程正比呢？？？？我们来看我们来看我们来看我们来看PCR的扩增方程的扩增方程的扩增方程的扩增方程：：：：从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+E)，所以E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于100%，是由于PCR反应中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特异性扩增或者Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手6北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-629517816297940882783852是引物二聚体造成。3.Real-timeqPCR的种类的种类的种类的种类根据real-timeqPCR的化学发光原理可以分为2大类：一类为探针类包括TaqMan®探针和分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。；一类为非探针类，其中包括如SYBR®GreenI或者特殊设计的引物(如LUX®Primers)通过荧光染料来只是产物的增加。3.1Taqman®探针法探针法探针法探针法Taqman®探针是最早用于定量的方法。就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5’端标记一个报告荧光基团，3’端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是FRET反应；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。3.2分子信标法分子信标法分子信标法分子信标法分子信标分子信标分子信标分子信标：：：：一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。Real-timeqPCR手册手册手册手册---手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手手把手教你从菜鸟到高手7北京百泰克生物技术有限公司@bioteke.comTel:010-6295178162979408827838523.3SYBR®Green法法法法SYBR®GreenI是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR®GreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最