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一氧化氮（Nitricoxide，NO）含量测定试剂盒使用说明微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC1475规格：100T/48S产品组成：提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体3mL×1瓶，4℃避光保存。试剂二：液体3mL×1瓶，4℃保存。试剂三：液体6mL×1瓶，4℃避光保存。产品说明：NO（NitricOxide，NO）广泛分布于生物体内神经、循环、呼吸、消化、泌尿生殖等系统中，特别是神经组织中较丰富。它作为细胞间及细胞内的信息物质，发挥信号传递的作用，是一种新型的生物信使分子，在机体的生理、病理过程中起着重要的作用。NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO2-，在酸性条件下，NO2-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基乙烯基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。为了排除样品色素等的影响，每个样品需做对照管。自备实验用品及仪器：天平、研钵或匀浆器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。操作步骤：一、样品处理：1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。10000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心15min，取上清置于冰上待测。3.体液和培养液等其它液态样品：直接测定。二、测定步骤和操作表：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。2、操作表对照管测定管样品（μL）100100试剂一（μL）50试剂二（μL）50试剂三（μL）5050混匀，4℃室温静置15min，于微量石英比色皿/96孔板，对照管调零，测定550nm处吸光值，记为A550。三、NO含量计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线回归方程为：y=0.016x-0.0103，R2=0.99861、组织样品：NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成1μmoLNO2-，相当于1μmoLNO。（1）按样本质量计算NO含量（μmoL/g）=（A550+0.0103）÷0.016×V反总÷（V样÷V样总×W）×10-3=0.125×（A550+0.0103）÷W（2）按样本蛋白浓度计算NO含量（μmoL/mgprot）=（A550+0.0103）÷0.016×V反总÷（V样×Cpr）×10-3=0.125×（A550+0.0103）÷Cpr2、其他样品：NO含量定义：25℃时，每升样品15min生成1μmoLNO2-，相当于1μmoLNO。NO含量（μmoL/L）=（A550+0.0103）÷0.016×V反总÷V样=125×（A550+0.0103）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mLb.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线回归方程为：y=0.008x-0.0103，R2=0.99861、组织样品：NO含量定义：25℃时，每克样品或每毫克蛋白15min生成1μmoLNO2-，相当于1μmoLNO。（1）按样本重量计算NO含量（μmoL/g）=（A550+0.0103）÷0.008×V反总÷（V样÷V样总×W）×10-3=0.25×（A550+0.0103）÷W（2）按样本蛋白浓度计算NO含量（μmoL/mgprot）=（A550+0.0103）÷0.008×V反总÷（V样×Cpr）×10-3=0.25×（A550+0.0103）÷Cpr2、细胞NO含量定义：25℃时，每104个细胞15min生成1μmoLNO2-，相当于1μmoLNO。含量（μmol/104cell）=（A550+0.0103）÷0.008×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）×10-3=0.25×（A550+0.0103）÷细胞数量（万个）3、其他样品：NO含量定义：25℃时，每升样品15min生成1μmoLNO2-，相当于1μmoLNO。NO含量（μmoL/L）=（A550+0.0103）÷0.008×V反总÷V样=250×（A550+0.0103）V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样品体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；W：样品质量，g；Cpr：蛋白浓度，mg/mL注意事项：1.试剂盒2-8℃保存。2.尽量使用新鲜样品进行检测，试剂三有腐蚀性，操作时请做好防护措施。3.若检测出得OD值在标准曲线范围外，请将样品进行适当的浓缩或稀释，并在计算公式中除以浓缩倍数或者乘以稀释倍数。4.最低检出限为0.65μmoL/L。