陈译Lipofectamine-2000中文使用说明书

Page1of5陈译LipofectamineTM2000使用说明书陈译LipofectamineTM2000使用说明书产品特点Lipofectamine2000转染真核细胞具有以下优点：对多种细胞和培养器皿具有很高的转染效率，成功转染的细胞系见数据库。核酸-Lipofectamine2000复合物（转染液）可直接加入细胞培养基中，不管培养基是否含有血清。转染后不必去除转染液，或者改变或添加培养基，但转染4-6小时后可去除转染液。注意事项推荐在混合前使用Opti-MEMI低血清培养基(Cat.No.31985-062)稀释Lipofectamine2000和核酸。转染过程中勿向培养基中添加抗生素，以免造成细胞死亡。不同批实验请保持细胞接种条件相同。请检测无血清培养基与Lipofectamine2000的兼容性，因为一些无血清培养基（如CD293,SFMII,VP-SFM等）可能抑制阳离子脂质体介导的转染。Page2of5陈译LipofectamineTM2000使用说明书脂质体RNAi或siRNA转染下列步骤适用于24孔板培养的哺乳动物细胞，至于其他培养材料，请参考转染规模调整，所有数量和体积均是按每孔计算。1.转染前一日，将细胞接种于500μl不含抗生素的培养基中，使其在转染时长至30-50%融合。2.转染液制备，每孔细胞用量如下：A.用50μlOpti-MEI低血清培养基（或者其他无血清培养基）稀释20pmolsiRNA（转染时siRNA终浓度为33nM），轻轻混匀。B.使用前轻轻摇匀Lipofectamine2000，然后取1μlLipofectamine2000在50μlOpti-MEI培养基中稀释，室温孵育5分钟。注意：请在25分钟内进行下一步操作。C.将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine2000混合（使总体积为100μl），轻轻混匀，室温放置20分钟（溶液可出现浑浊）。3.在每孔细胞中加入100μl转染液，轻轻摇匀。37℃培养24-96小时后检测基因表达，转染4-6小时后可更换培养基。脂质体siRNA转染优化可调整siRNA与Lipofectamine2000的用量以优化转染，在24孔板，siRNA可在10-50pmol之间调整，Lipofectamine2000可在0.5-1.5μl之间调整，在增加细胞密度时也应优化转染剂量。更多RNAi转染技巧可参考《成功RNAi七步法》（）。Page3of5陈译LipofectamineTM2000使用说明书脂质体DNA转染下列步骤适用于24孔板培养的哺乳动物细胞，至于其他培养材料，请参考转染规模调整，所有数量和体积均是按孔计算。大部分细胞系所使用的DNA（μg）与Lipofectamin2000（μl）的比值为1:2到1:3，转染高密度细胞可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。优化转染是必需的（见优化脂粒DNA转染）。1．贴壁细胞：转染前一天每孔0.5-2×105个细胞接种于500μl不含抗生素的培养基中，在转染时细胞可长至90-95%融合。悬浮细胞：在配制转染液前每孔4-8×105个细胞接种于500μl不含抗生素的培养基中。2．转染液制备，每孔细胞用量如下：A．用50μlOpti-MEI低血清培养基（或者其他无血清培养基）稀释质粒DNA，轻轻混匀。B．使用前轻轻摇匀Lipofectamine2000，然后取适量Lipofectamine2000在50μlOpti-MEI培养基中稀释，室温孵育5分钟。注意：请在25分钟内进行下一步操作。C．将前两步所稀释的DNA和Lipofectamine2000混合（使总体积为100μl），轻轻混匀，室温放置20分钟（溶液可出现浑浊）。注意：转染复合物常温下可在6小时内保持稳定。3．在每孔细胞中加入100μl转染液，轻轻摇匀。4．37℃培养18-48小时后检测基因表达，转染4-6小时后可更换培养基。5．对于稳定转染，在转染24小时后以1:10稀释接种于新鲜培养基中，第二天可加入选择培养基。Page4of5陈译LipofectamineTM2000使用说明书优化脂质体DNA转染可通过改变细胞密度、质粒DNA密度和Lipofectamine2000浓度以优化转染。要保证细胞融合在90%以上，DNA(μg):Lipofectamin2000(μl)可在1:0.5到1:5之间进行调整。Page5of5陈译LipofectamineTM2000使用说明书转染规模调整不同培养材料转染液、细胞和培养基的用量按照培养材料面积换算。在96孔板细胞高通量自动分析系统，推荐每孔使用50μl转染液。注意：在96孔板，可将细胞直接接种于转染液中以实现快速转染，直接在培养板中配制转染液100μl，直接将细胞加入培养板中，其密度为上述方法的2倍，细胞在转染液中可正常贴壁。培养材料每孔面积接种培养基稀释用Opti-MEIsiRNA转染DNA转染siRNALipofectamine2000DNALipofectamine200096孔板0.3cm2100μl2×25μl5pmol0.25μl0.2μg0.5μl24孔板2cm2500μl2×50μl20pmol1.0μl0.8μg2.0μl12孔板4cm21ml2×100μl40pmol2.0μl1.6μg4.0μl6孔板10cm22ml2×250μl100pmol5μl4.0μg10μl60-mm20cm25ml2×0.5ml200pmol10μl8.0μg20μl10-cm60cm215ml2×1.5ml600pmol30μl24μg60μl2009年6月于中山大学肿瘤防治中心