液相色谱柱的应用

LOGO液相色谱柱的应用高效液相色谱培训系列目录一、液相色谱分离原理二、液相色谱柱的结构三、液相色谱柱的选择四、色谱柱的使用五、分析条件的影响六、色谱柱的维护一、HPLC分离原理样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件)分配过程分配系数-KK=K=常数（T恒定）Cm=组分在流动相中的浓度Cs=组分在固定相中的浓度CSCm容量因子k00tttkR是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——容量因子(capacityfactor)，也称分配比(partitionratio)，以k表示。k=Ms/MmMs为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k色谱理论：塔板理论--柱分离效能指标色谱理论：速率理论--影响柱效的因素速率理论是荷兰学者范·弟姆特于1956年提出的,表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范·弟姆特方程式）。速率方程H=A+B/u+C·uH：理论塔板高度；u：流动相的线速度色谱理论：速率理论--影响柱效的因素H=A+B/u+C·u色谱理论：分离度分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比。R=2（TR2-TR1）/（W2+W1）计算表明：1：R0.8时，两组分不能完全分离2：R=1时，两组分峰重叠约2%3：R=1.5时，两组分峰完全分离。R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多。降低柱温、增加柱长可使R提高。样品组分的分离液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器泵输液分离检测记录AEGBCDF进样阀进样HPG-3x00RS泵–在整个流速范围下保持800bar高压–最高流速达到5ml/minWPS-3000RS自动进样器–进样周期15秒–进样阀耐压1000barTCC-3000RS柱温箱–5-110°C温度范围–柱后冷却DAD-3000RS检测器–全波长扫描范围数据采集速率100HzAcclaim®2µm色谱柱–耐压800barChromeleon®CMS软件及时获得结果UltiMate3000RSLC快速分离液相11/11/201913高性能－UltiMate3000x2三元梯度系统有六通道脱气机的溶剂架独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内带温控选项的自动进样器独特的柱温箱可放置两个柱切换阀可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器液相色谱柱的应用二、色谱柱的结构和安装色谱柱的构造.色谱柱管常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理。钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层。色谱柱规格内径：常用4.6mm，2.1mm柱长：常用50，100，150，250cm色谱柱的构造色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成。柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。色谱柱子的构造不同厂家和型号的柱子会有一定的差别液相色谱柱的构造在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。色谱柱的构造柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用颗粒粒径在3—10µm的范围内。正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、-NH2、苯基等。液相色谱柱的安装色谱柱的安装：拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。液相色谱柱的安装按柱管上标示的流动相流向，(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接。连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的链接管。连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止。如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧1／4圈，直至不漏液为止。连接接管必须注意：如果伸出的管线长度过长，可能漏液螺母坡度不匹配，密封性差死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积色谱连接注意事项1.尽量减少死体积连接管线与接头0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2.1内径色谱柱0.17mm内径管线用于分析型HPLC中2.1~4.6内径色谱柱0.25mm内径管线用于半制备型HPLC中9.4内径色谱柱0.5mm内径管线用于制备型HPLC中21.2内径色谱柱50mL柱外体积（管线）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外体积Time(min)0.00.51.01.52.04321样品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素色谱柱:StableBondSB-C18,4.6x30mm,3.5mm流动相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min温度:35°C液相色谱柱的应用三、液相色谱柱的选择分离模式的选择样品溶于有机溶剂溶于水溶于四氢呋喃非离子化离子化溶于有机溶剂溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用键合相的反相模式用键合相的反相模式低分子凝胶渗透色谱用键合相的反相模式抑制电离反相键合相色谱用硅胶的正相模式离子交换模式凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱大孔填料的离子交换模式用大孔填料的反相模式分子量2000分子量2000低分子凝胶渗透色用硅胶的正相模式用键合相的正相模式1.填料：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等2.键合相：C4、C8、C18、苯基、氨基等（封端技术）3.孔径：60-100A分子量2000300A分子量20004.粒径：2um-10um5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）6.长度：10、15、25、30mm柱子的选择正相&反相色谱正相色谱极性:固定相流动相固定相-极性流动相(正己烷,异丙醇)-非极性极性物质后出峰反相色谱极性:固定相流动相固定相-非极性流动相(甲醇,水,乙腈,THF,)-极性非极性物质后出峰正相色谱CBACBACBACBA低极性流动相中极性流动相极性:ABC反向色谱法固定相（非极性）C18,C8,C4,苯基流动相(极性)Water,MeOH,MeCN,THF弱酸，弱碱溶剂极性各种反相填料的使用比例C18PhenylC4C8其他C18PhenylC4C8其他反向色谱法高极性流动相中极性流动相极性:ABCABCABC流动相1.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。2.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇最常用的是正已烷，不同混合溶剂的粘度比较柱填料基质•硅胶基质-pH2~8•Al2O3.nH2O-pH1~14•聚合物基质-pH1~14高pH下,硅胶会溶解低pH下,键合相会断裂化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀，导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损色谱柱的性能参数物理性质•硅胶纯度•色谱柱尺寸•颗粒形状•粒径•表面积•孔径•键合类型•碳覆盖率•封端化学性质色谱柱的物理性质硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱子的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10µm表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å硅胶纯度A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不易发生拖尾一般金属浓度35ppm);99.995%纯度的二氧化硅A型、B型硅胶比较A型硅胶化合物被吸收B型硅胶峰型峰高分离正常金属敏感测试色谱柱Diamonsil（钻石）C185um，150x4.6mm流动相CH3CN/Water(50:50)流速1.0mL/min检测UV@230nm硅胶中如果存在金属杂质，将与2,3-二羟基萘（峰2）形成金属螯合物，保留时间延长并导致峰形拖尾。2,7-二羟基萘（峰1）不与金属作用并作为内标物。色谱柱子的尺寸色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)–运行时间长，分离度高•窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-23mm)-载样量高颗粒形状与大小颗粒形状：1球形2无定形球形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µm5µm7µm10µm填料粒度商品化的填料从2μm~30μm目前常用于分析3μm,5μm,10μm用于半制备10μm,15μm用于制备15μm~30μm3μm填料粒径的影响NFlow3µm5µm10µm粒径与柱效核壳U-HPLC的科学原理美国AdvancedMaterialTechnologyInc.Kirkland博士发明。内核1.7um,因此柱效至少相当于UPLC;外层0.5um,总粒径2.7um,因此色谱柱压力接近3.0um色谱柱。流速设定色谱柱尺寸和填料粒径的影响1.C184.6*250,5um;242nm,甲醇15%→60%(45min)2.C184.6*150,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(25min)3.C184.6*50,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(10min)比表面积与孔径表面积---对色谱分离的影响高比表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力、柱容量和分离度.比表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态,对于梯度淋洗尤为重要孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW2,000,选择100Å的孔径样品MW2,000,选择300Å的孔径比表面积的比较比表面积与孔径的影响大孔径填料适用于大分子分析大孔径300Å全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配300Å孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300C18(300Å)C18(80Å)PW1/2孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形300Å孔径可改善大分子的峰形色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min温度:RT检测器:UV282nm•溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径•窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80Å)300SB-C3(300Å)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素)MW.926分子量虽小但体积较大