内含肽原理-NEB

NEB内含肽原理•内含肽介导的纯化系统由NEB公司建立，可以仅用一步亲和层析从融合蛋白中纯化出目的蛋白（IMPACT™试剂盒）。•包含载体为pTYB11系列•pTYB11载体结构为•设计的正向引物酶切位点会和载体上相同的位点融合，因此内含肽的切割位点正好位于目的基因的N端，因此不会添加多余序列•由该载体表达的融合蛋白含有几丁质结合域(CBD)和内含肽(Intein)两部分功能元件，其C端为目的蛋白。•几丁质结合域可与几丁质树脂紧密结合，这样目的蛋白、内含肽和几丁质结合蛋白在一起以融合蛋白形式表达。•内含肽是一种自剪接元件，一端与几丁质结合蛋白构成载体蛋白，另一端与目的多肽相结合，当含有巯基的化合物（DTT，β-巯基乙醇）存在时，内含肽与目的多肽间肽键断裂，经缓冲液洗脱而得到目的多肽，而载体蛋白仍吸附在几丁质柱上。然后，用碱液洗脱将几丁质结合蛋白释放，从而实现柱的再生。纯化流程示意图•内含肽自我剪切效率•切割效率一般为为23度16小时切割80%-90%•N端首个氨基酸为Cys,该氨基酸存在时会影响切割效率，所以NEB认为不适合采用内含肽载体来构建。切割位最佳氨基酸