qPCR与ChIP

qPCR与ChIP生物技术1301第三组顾心怡主讲章梦瑶整理资料程思远做ppt谢远瞩整理资料唐鹏整理资料张楚悦整理资料标题和内容版式与列表qPCR简介qPCR的原理ChIP简介标题和内容版式与图表012345类别1类别2类别3类别4图表标题系列1系列2两栏内容版式与表格此处为第一个要点此处为第二个要点此处为第三个要点组A组B类18295类27688类38490两栏内容版式与SmartArt组A•任务1•任务2组B•任务1•任务2组C•任务1此处为第一个要点此处为第二个要点此处为第三个要点qPCR仪器definationQPCR的英文全名是Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem实时荧光定量核酸扩增检测系统实时定量基因扩增荧光检测系统，简称QPCR工作原理工作原理实时PCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光CCD摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时PCR扩增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和Ct值qPCR数据分析相关表达水平分析qPCR运行过程ChIP简介、工作原理及实验过程简介Chip”技术作为生命科学的最新技术近些年来发展迅速，被广泛的应用于各个生命科学领域包括疾病预测与诊断基因突变检测遗传学产前诊断芯片技术包括最常见的DNA芯片（基因芯片）、蛋白芯片、microRNA芯片及最新开放的新型芯片等。实验原理染色质免疫沉淀技术（ChIP）通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。ChIP技术最大的优点就是在活体细胞状态下研究了蛋白质和目的基因结合状况，减少了体外实验的误差。在活体细胞中，先对与调节蛋白结合的染色质进行分离，然后通过一定的方法（例如：超声波）随机剪切染色质，用调节蛋白的抗体沉淀目的染色质，再通过一定手段把目的染色质上的蛋白质去除掉，最后用PCR等方法检测鉴定共沉淀的DNA片段的特性。实验方法1.细胞固定甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。2.染色质断裂交联后的染色质可被超声波或MicrococcalNuclease切成400~600bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。ChIP试验的一般过程THANKYOU