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M蛋白检测在多发性骨髓瘤诊治中的思考王金英多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是以单克隆浆细胞异常增生并分泌大量单克隆免疫球蛋白为特征的一种恶性肿瘤性疾病，这种大量单克隆免疫球蛋白就是M蛋白。M蛋白的本质是无功能的免疫球蛋白或免疫球蛋白的片段。它是MM的主要特征之一，也是MM重要的肿瘤标志物。MM好发于中老年人，近年来发病率有逐年上升的趋势，且发病年龄呈现年轻化趋势[1]。M蛋白的检测对于MM的诊断具有重要的意义。而实验室常规检验项目缺乏特异性，不能有效地检测出M蛋白，导致MM漏诊或误诊率较高[2]。目前M蛋白检测主要有以下检测方法，现将常见检测方法的特点和意义汇总如下：1．血清蛋白电泳（SPE）1.1血清蛋白电泳的原理由于蛋白质具有两性解离性质，在不同PH值的缓冲液中可以带负电荷或正电荷，在电场中向阳极或阴极运动，称为电泳（electrophoresis）。由于其等电点不同，分子大小、形状和荷质比的不同，使不同蛋白质分子具有不同的电泳迁移率，在一定的支持介质中可借以分离各种蛋白质。电泳后由正极到负极可分为，白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白五个区带。血清蛋白电泳可以初步了解血清蛋白中主要组分的是否正常，是否存在可疑M蛋白。通过血清蛋白电泳还可以反映肝脏疾病、肾脏疾病以及风湿免疫系统疾病等的病变情况。1.2血清蛋白电泳常用的两种方法目前临床实验室应用最多的血清蛋白电泳的方法主要有两种：毛细管电泳法和琼脂糖凝胶电泳法。两种方法各有优缺点。毛细管电泳法自动化程度比较高，可以和常规生化检测项目组合，出报告时间短，适合大批量人群的筛查。琼脂糖凝胶电泳相对于毛细管电泳法来说，相对耗时费力，但是琼脂糖凝胶法有实物图谱，条带的识别度较好，对于浓度不高的M蛋白有明显的优势。M蛋白检测以琼脂糖凝胶电泳应用最为普遍。1.3血清蛋白电泳检测M蛋白的特点血清蛋白电泳是唯一的可以对M蛋白定量实验，这种定量是利用专门软件人为手工描记出M蛋白的百分比，其结果是近似结果；其结果的判断和定量都有赖于检测人员具有一定的经验，同时具有某种程度的主观性；血清蛋白电泳对于M蛋白检测阳性率大约为80%左右；同时灵敏度较高的检测区域主要在γ球蛋白区域和β球蛋白区域的一部分。2．血清免疫固定电泳（sIFE）2.1血清免疫固定电泳的原理血清免疫固定电泳（serumimmunofixationelectrophoresis，sIFE）是一种将琼脂糖凝胶蛋白电泳与免疫沉淀相结合的一种检测技术。即将血清在琼脂糖凝胶上进行区带电泳，再与特异性抗体反应，从而检出与抗体结合的相应抗原。具有周期短、敏感性高、特异性强和分辨率高的优点，主要用于M蛋白的检测与鉴定。2.2何种情况下须做血清免疫固定电泳血清IFE常用于M蛋白相关疾病的鉴定。如果患者①血清蛋白电泳出现M蛋白；②出现原因不明的丙种球蛋白偏低；③根据患者的年龄，病史（骨折、贫血、肾功损伤等），患者有高骨髓瘤风险；④血清蛋白电泳结果正常，但患者有骨髓瘤、轻链沉积病、淀粉样病变等疾病临床症状等时，建议做血清免疫固定电泳检测。2.3sIFE结果的判断①正常结果：参比泳道、μ链、γ链及α链重链泳道（因IgD及IgE型M蛋白检出率较低，常规不做δ链和ε链两种重链的免疫固定）均没有异常条带，κ及λ轻链泳道亦无异常条带，即为sIFE阴性。②异常结果：对于完整分子M蛋白，参比泳道、三种重链（μ链、γ链或α链）任一泳道、两种轻链（κ及λ轻链）其中之一泳道，三者均形成对应的异常条带，即为sIFE阳性，同时根据形成异常条带的泳道报告M蛋白的重链和轻链的类型。对于单独轻链阳性的标本，须加做δ链和ε链两种重链的免疫固定。IgE型MM较罕见，IgD型MM的发病率国内翟玉华等[3]报道发病率为6.22%,明显高于一些国外文献报道。且因其M蛋白百分比不高，或条带位置不典型极易误诊漏诊，须引起高度注意。③寡克隆免疫球蛋白：正常情况下，免疫球蛋白是多克隆的，即抗体是所有的免疫球蛋白均增加，在电泳背景下无特殊的可分辨清楚的克隆区带。而寡克隆免疫球蛋白则是由于个别免疫球蛋白克隆增生。在IFE时在多个泳道形成多条(2)窄的条带，通常比较微弱。寡克隆反应代表对某种特殊抗原或一系列抗原的体液免疫反应。可见于骨髓移植或MM治疗后恢复期免疫重建的过程中，同时同许多感染、自身免疫和炎症疾病有关。可以视同sIFE阴性。2.4血清免疫固定电泳检测M蛋白的特点①血清免疫固定电泳是血清中M蛋白检测的金标准，其阳性率高于血清蛋白电泳，可达90%以上；②免疫固定电泳定性实验，结果的判断具有某种程度的主观性；③适用于检测完整的M蛋白，对于单独轻链型M蛋白容易漏诊。3.尿免疫固定电泳（uIFE）3.1尿免疫固定电泳的目的是检测单克隆游离轻链，即本周氏蛋白。本周氏蛋白是1844年HenryBenceJones在一个骨髓瘤患者尿中发现的一种具有特殊凝溶性质的蛋白，这种蛋白质在40－60℃发生沉淀，加热煮沸时溶解，冷却后又沉淀。当时发现的其实是轻链二聚体。后来人们发现骨髓瘤患者尿中有本周氏蛋白并不少见，其本质是单克隆游离轻链。3.2uIFE结果的判断①正常结果：参比泳道、μγα三价重链泳道，κ及λ轻链泳道、游离κ及λ轻链泳道，5条泳道均无异常条带，即为uIFE阴性。②异常结果：参比泳道有异常条带、μγα三价重链泳道，κ及λ轻链泳道、游离κ及游离λ轻链泳道，4条泳道任一泳道有异常条带，即为uIFE阳性。同时根据形成异常条带的泳道报告尿中存在完整M蛋白分子或者单克隆游离轻链及其类型。3.3尿免疫固定电泳的特点①尿免疫固定电泳主要用来检测本周氏蛋白（单克隆游离轻链）；②尿免疫固定电泳本身为定性实验，其结果的判断具有一定的主观性；②对于轻链型M蛋白具有较高的阳性率；④对于有肾脏意义的单克隆免疫球蛋白血症（MGRS），uIFE比sIFE有更高的阳性率（71.9%vs50.0%，n=32)[4].4．免疫球蛋白和总轻链定量4.1免疫球蛋白及总轻链的检测方法目前临床实验室对于免疫球蛋白及总轻链的检测方法主要有两类方法，一类是在全自动生化分析仪上采用透射免疫比浊法测定；另一类是在特定蛋白分析仪上采用散射免疫比浊法检测。陈智平[5]等以血清IgG测定为例，对两种方法进行比较和分析。尽管两种方法的差异可以接受，仍推荐使用准确度更高的散射免疫比浊法。4.2免疫球蛋白定量的特点：典型情况下，①具有完整M蛋白分子的患者，其免疫球蛋白测定会出现IgG，IgA及IgM一高两低的情况。同时会有一种轻链增高，一种轻链减低。②具有单独轻链型M蛋白的患者，常常出现IgG，IgA及IgM均减低，甚至两种轻链也同时减低。③慢性肝病、自身免疫性疾病通常IgG，IgA及IgM两种以上的免疫球蛋白增高，同时会有一种或两种轻链同时增高。4.3治疗后免疫球蛋白和总轻链定量的特点：①治疗过程中免疫球蛋白和总轻链定量的改变治疗有效：病理性免疫球蛋白及其轻链水平明显下降，本底免疫球蛋白水平上升。②治疗无效或疾病进展：病理性免疫球蛋白及其轻链水平无明显变化或持续上升。5．血清游离轻链检测及其意义5.1血清游离轻链的合成与代谢血清游离轻链（sFLC）是在B-细胞和浆细胞的正常的免疫球蛋白合成过程中，由于重链和轻链合成速率不同，导致血液中有大量的、过剩的κ或λ轻链分子的产生。由于游离轻链分子量小，可以自由滤过肾小球滤膜，绝大多数在肾近端小管重吸收，正常人每天可以向尿液中排泄1-10mg的游离轻链，与分泌型IgA及其它的免疫球蛋白一起存在[6]。当发生恶性浆细胞病时，单克隆的浆细胞大量增生，产生大量匀质的单克隆游离κ或λ轻链分子由肾小球滤过。当滤过的FLC超过了近端小管的分解和重吸收能力后，即从尿中排泄或到达髓袢升支与Tamm-Horsfall蛋白以管型的方式沉淀下来，常造成骨髓瘤肾病[7]。sFLC是一种重要的肿瘤标志物[8],sFLC检测是近年逐步建立起来的对血液中的游离轻链自动化定量的方法，具有敏感性高，特异性好的特点。5.2血清游离轻链的参考范围FREELITETM试剂采用的是Katzmann等2002年发表于临床化学杂志的参考范围[9]。具体如下：正常成人血清中位浓度（mg/L）95%参考区间κFLC7.33.3-19.4λFLC12.75.7-26.3中位数100%参考区间κ/λ比值0.60.26-1.655.3血清游离轻链检测的意义5.3.1比普通M蛋白鉴定更敏感，能更早的反映治疗效果及疾病的复发；5.3.2在疗效判断标准上，已将sFLC作为骨髓瘤严格完全缓解的标准之一。治疗后sFLC阴性的骨髓瘤患者较免疫固定电泳转阴性（但sFLC阳性）有更长的生存期；5.3.3sFLC在IgD型、轻链型、无分泌型骨髓瘤和淀粉样变性的诊治中有独特的、无可替代的价值；5.3.4sFLC数值及其中κ/λ比值异常可作为判断良恶性浆细胞病的重要标准。总之，在M蛋白鉴定中，要注重不同方法的联合检测，充分利用方法的优势，最大限度得减少漏检。同时要注意不同方法结果的符合性，当一些结果间相互矛盾时，要加强检验与临床的积极有效的沟通，以期为临床提供准确可靠的诊疗依据。参考文献：[1]白砚霞，陆敏秋，吴梦青，等．多发性骨髓瘤178例I临床分析[J]．中国全科医学，2008，11(7)：1284．[2]张智慧，李云婷，张海谱，等．实验室检测与多发性骨髓瘤误诊分析．中国误诊学杂志，2005，5(7)：1264-1265．[3]翟玉华，宿莉，孙卫红免疫固定电泳检测IgD型骨髓瘤现代检验医学杂志，2003,18(4):22-23.[4]李超，文煜冰，李航血游离轻链在有肾脏意义的单克隆免疫球蛋白血症中的诊断价值中华医学杂志，2017;97(30):2344-2348[5]陈智平，伍慧玲，陈志坚等透射和散射比浊法测定血清免疫球蛋白G的比对分析AppliedPrevMed,2010,16(5):308-310.[6]BradwellAR,MeadGP,Carr-SmithHD.Serumfreelightchainanalysis.3rdEdition;TheBindingSite,Birmingham.[7]GrazianiM,MerliniGandPetriniC.Guidelinesfortheanalysisofbencejonesprotein.ClinChemLabMed，2003;413:338-346.[8]KangSY,SuhJT,LeeHJ,etal.Clinicalusefulnessoffreelightchainconcentrationasatumormarkerinmultiplemyeloma.AnnHematol,2005;84:588-593.[9]KatzmannJA,ClarkRJ,AbrahamRS,etal.Serumreferenceintervalsanddiagnosticrangesforfreeκandfreeλimmunoglobulinlightchains:relativesensitivityfordetectionofmonoclonallightchains.ClinChem，2002;48:1437-1444.