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1HTRF产品纵览HTRF的优势HTRF是不需要洗涤的ELISA。其优势如下：操作非常简单体系非常稳定反映样品的实际情况，假阳性假阴性率低，可去除由于天热产物自发荧光引起的背景HTRF原理HTRF技术基于时间分辨荧光（TRF）和荧光共振能量转移（FRET）两大技术原理时间分辨荧光（TRF）TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质。它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级，镧系元素的半衰期是毫秒级，有6个数量级的差别。所以，在检测时，TRF有一个时间延迟---50微秒。经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零。所以，TRF的背景非常低，反映样品的实际情况。荧光共振能量转移（FRET）FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移。由于Acceptor的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。HTRF的能量供体HTRF的能量供体是铕（Eu）和铽（Tb）的穴状化合物。在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定。这个结构是由J.M.Lehn’s教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。图1：时间分辨荧光技术原理Donor与Acceptor距离较远，无FRETDonor与Acceptor距离较近，产生FRET图2：荧光共振能量转移技术原理2HTRF的能量受体HTRF的能量受体也有两种，XL665和d2。它们的光学性质相同，分子量不同。前者分子量为105KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC）。我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性。后者分子量为1KD，在某些实验中有独特的优势。HTRF的操作步骤HTRF的操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育、检测即可，如图4所示。HTRF的数据分析HTRF采用了比值法来处理数据，可以去除由于溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。如图5所示，由于溶液通透率不同导致的读数不同，如果不用比值法，则会得出错误的结论。HTRF的应用范围G蛋白偶联受体研究：受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测激酶活性检测：胞外激酶活性检测胞内激酶活性检测生物标志物检测：基于抗体的夹心法和竞争法检测抗体检测：抗体重链含量测定、抗体轻链含量测定生物过程分析：GST含量测定、HIS含量测定、CHO宿主蛋白含量测定免疫过程分析：CD16结合检测、CD32结合检测、CD64结合检测相互作用分析：蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-DNA、蛋白-RNA蛋白修饰：蛋白甲基化、蛋白乙酰化、蛋白泛素化、蛋白水解图3：穴状化合物的结构图4：HTRF的操作步骤图5：HTRF比值法数据分析可去除样品干扰3图6：HTRF的应用范围4应用产品列表5HTRF检测的仪器Cisbio与几乎所有的仪器供应商都建立了合作伙伴关系，下面是经过验证的仪器列表。所有这些仪器都标有”HTRF®”的标志。PHERAstarFSPHERAstarPlusPHERAstarFLUOstarOmegaPOLARstarOmegaRUBYstarInfiniteF200ProInfiniteM1000InfiniteF500Ultra/evolutionGENiosProSafire²SpectramaxParadigmSpectramaxM5eFlexStation3AnalystAD,HT>SynergyH1SynergyH4Synergy4Synergy2MithrasLB940Artemis101用于HTRF检测的微孔板公司产品描述实验体积产品处理方式产品货号Greiner96-w160-200µLWhite-TC*-sterile655083Greiner96-w160-200µLBlack655209Greiner96-w160-200µLBlack-TC*-sterile655086Greiner96-w160-200µLBlack-TC*-sterile655079Greiner96-w160-200µLWhite-TC*-sterile655073Greiner384-w80-100µLBlack-TC*-sterile781086Greiner384-w80-100µLBlack-TC*-sterile781079Greiner384-w80-100µLWhite-TC*-sterile781073Greiner384-w80-100µLBlack781209Greiner384-w80-100µLWhite-TC*-sterile781080Greiner384-wlow-volume15-20µLWhite-TC*-sterile784080Greiner1536-w5-10µLWhite783075Greiner1536-w5-10µLBlack783076Greiner1536-w5-10µLWhite-TC*-sterile782080Greiner1536-w5-10µLBlack-TC*-sterile782086Greiner1536-w5-10µLWhite-TC*-sterile782078Greiner1536-w5-10µLBlack,sterile782092Greiner1536-w5-10µLWhite,sterile782073Greiner1536-w5-10µLWhite-TC*-sterile782093Corning96-w160-200µLBlack,NT3915Corning96-w160-200µLWhite,NT3912Corning96-whalf-area80-100µLBlack,NT3694Corning96-whalf-area80-100µLWhite,NT3693Corning384-w80-100µLBlack,NT3573MolecularDevices96-whalfareaandhalf-volume30-40µLBlack,NT42-000-0117……6G蛋白偶联受体功能性检测HTRF技术可用来进行第二信使检测、胞内信号分子检测和受体配体结合检测方案，从而从全方位帮助您进行G蛋白偶联受体的研究。cAMP检测Cisbio提供四个试剂盒进行cAMP检测，分别针对不同的灵敏度和线性范围，其检测原理均基于竞争法。试剂盒中有Eu标记的cAMP抗体和d2标记的cAMP，抗体可以识别cAMP，使Eu与d2接近。Eu受到激发后，其能量可以共振转移到d2上，产生信号。当细胞中有cAMP产生时，其与d2标记的cAMP竞争抗体结合位点，使后者与Eu标记的抗体距离增大，不能产生能量转移，信号下降。四个试剂盒的比较图7：G蛋白偶联受体功能性检测图8：cAMP的检测原理图9：cAMP试剂盒的比较7cAMPdynamic2拥有较高的检测灵敏度和比较大的线性范围，适合于大多数Gi/s实验cAMP操作步骤试剂盒操作步骤非常简单，只需要将细胞处理完毕，然后加入d2标记的cAMP和铕标记的抗体即可。订购信息产品名称产品规格产品货号cAMPdynamic21,000tests62AM4PEB20,000tests62AM4PEC100,000tests62AM4PEJcAMPfemto21,000tests62AM5PEB20,000tests62AM5PEC100,000tests62AM5PEJcAMPHiRange1,000tests62AM6PEB20,000tests62AM6PEC100,000tests62AM6PEJcAMPfemtoTb1,000tests62AM7PEB20,000tests62AM7PEC100,000tests62AM7PEJIP-One检测IP-One试剂盒是钙流检测方法的替代解决方案。钙流反应非常快，需要加样之后马上检测，所以需要配备自动加样的仪器才能检测。而且，钙流检测只能针对与受体快速结合并发挥作用的化合物，不适合反应较慢的化合物。IP-One可以非常好地弥补上述缺憾。IP-One检测反映的是第二信使IP3的含量。当样品中加入LiCl后，IP-One不再代谢，而是蓄积在细胞内。试剂盒基于竞争法，其中含图10：cAMP操作步骤图11：IP-One操作步骤8有Tb标记的抗IP1单抗和d2标记的IP1。细胞所产生的IP1和试剂盒所提供的标记了d2的IP1竞争抗IP1抗体的抗原结合位点。当Tb标记的抗IP1抗体与d2标记的IP1结合后，会发生能量共振转移，产生比较大的信号。随着细胞内产生的IP1增多，游离的IP1与抗体结合增多，信号逐渐减少。IP-One操作步骤整个实验过程非常简单，只需要将细胞处理完毕，加入d2标记的IP1和Tb标记的抗IP1抗体，检测即可。可以用新鲜培养的细胞，也可以用冷冻细胞。订购信息产品名称产品规格产品货号1,000tests62IPAPEBIP-OneTbkit20,000tests62IPAPEC100,000tests62IPAPEJIP-OneELISA96tests72IP1PEA96*5tests72IP1PED磷酸化ERK1/2的检测ERK1/2是G蛋白偶联受体所有信号的会聚点，所以可以用磷酸化ERK含量的变化来反应G蛋白偶联受体是否被活化或者抑制。磷酸化ERK1/2检测是基于双抗体夹心法的原理。在试剂盒中含有两个抗体，一个抗体是抗磷酸化ERK1/2的抗体，标记d2；另一个抗体是抗ERK1/2其它位点的抗体，标记Eu，如图13所示。图12：IP-One操作步骤图13：磷酸化ERK1/2的检测原理9磷酸化ERK1/2操作步骤实验时，将细胞处理完毕，然后裂解细胞。将裂解转移到新的微孔板中，加入两种抗体混匀，室温孵育2小时即可进行检测。订购信息产品名称产品规格产品货号500tests64ERKPEGCellul'erk10,000tests64ERKPEH50,000tests64ERKPEIG蛋白偶联受体结合检测Tag-lite技术简介Tag-lite是SANP-Tag与HTRF技术相结合，进行活细胞表面受体分析的一种技术。SNAP是具有自我标记功能的酶，可特异地与底物苄甲基鸟嘌呤（BG），通过苄甲基不可逆共价结合。由于底物可与各种染料形成衍生物，这样，通过共价反应，染料就标记到SANP（图15）。同时，SNAP可以非常容易地融合到蛋白质的N端或C端。通过构建SNAP与目标受体的表达载体，将SNAP与目标受体共表达到细胞膜表面。然后，加入标记了Tb的底物，我们就得到了标记了Tb的目标受体。进行结合实验时，我们加入标记了d2的配体。由于配体与受体结合，Tb与d2之间发生能量共振转移，产生HTRF信号。化合物如果能够与受体结合，则与d2标记的配体竞争，HTRF信号降低。图14：磷酸化ERK1/2操作步骤图15：GPCR-SNAP与Tb穴状化合物结合10受体配体结合实验的操作步骤首先构建SNAP与目标GPCR的共转染质粒，然后转染细胞，得到共表达SNAP和目标GPCR的细胞。加入结合了Tb的SNAP底物，37℃孵育1小时。SNAP与底物反应，生成标记了Tb的SANP，即生成标记了Tb的GPCR细胞株。进行受体配体结合实验时，加入d2标记的配体，受体配体结合，Tb与d2接近，产生HTRF信号。Tag-lite技术的优势无放射性基于活细胞的GPCR受体配体结合分析的平台，构建的细胞可用于所有功能性检测采用HTRF技术，背景低，操作简单，数据质量高Tag-lite技术所需要的实验材料含有SNAP的质粒：提供含有信号肽的空质粒或转染了