碱性蛋白酶活力的测定

实验四碱性蛋白酶活力的测定一、实验原理以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。二、试剂和仪器试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、酶液的萃取称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。2、酶活力的测定样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。空白管：先在每支试管中各加入1.0mL1%酪蛋白溶液和2.0mL5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液和1mLFolin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。3、标准曲线为了确定酪氨酸与OD值的对应关系，需事先用不同浓度标准酪氨酸溶液与Folin试剂反应显色，测定OD值标准曲线。（1）不同浓度的标准酪氨酸溶液按下表配置：管号酪氨酸的浓度（微g/mL）100微g/mL酪氨酸溶液（mL数）蒸馏水（mL数）空白0011100.10.92200.20.83300.30.74400.40.65500.50.56600.60.4（2）向上表配制的不同浓度的酪氨酸溶液中分别加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，Folin试剂1mL，置于40℃恒温水浴显色20min，在680nm下以空白为对照，测定各样品管溶液的吸光度。（3）以吸光度（OD）为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，由直线斜率计算K值。四、数据记录与处理1、根据标准曲线计算K值酪氨酸浓度/[µg/mL]0102030405060吸光度0.0000.0780.1770.2860.3610.4030.533用Excel拟合得，K=114.7（OD值为1时相当的微克数）。2、酶活力计算酶液加入量/mL相当于粗酶制剂/克空白管OD值样品管OD值净OD值酶活力/[*104单位数/克酶制剂]平均酶活力/[*104单位数/克酶制剂]0.20.00010.0000.3610.36116.5613.480.40.00020.0000.5690.56913.050.60.00030.0000.7090.70910.84酶活力的计算：酶活力（单位数/克酶制剂）=4/10×K×OD×n式中：4——反应混合物总体积为4mL；10——酶反应时间为10min；K——标准曲线中OD值为1时相当的酪氨酸微克数，结果为114.7；n——酶液的稀释倍数五、讨论1、酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。2、用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。3、因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用。